德国汉堡大学罗兰-维森丹格教授:冠状病毒大流行的起源研究(中文译文)第二部分

翻译、发稿:gogogo4
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3 冠状病毒大流行的前史:武汉病毒所对蝙蝠冠状病毒的研究和基因操作
在以往的冠状病毒相关疾病中,如SARS(2003年),原本来自蝙蝠的冠状病毒在中间宿主中发生了变异,使得后续传染给人类。迄今为止,还没有发现蝙蝠将冠状病毒直接传染给人类。病毒学家在此背景下讲的是”适应障碍”。因此,通过深入研究确定各种冠状病毒相关疾病的潜在中间宿主具有重要意义。
与以往爆发的冠状病毒相关疾病相比,本次大流行的引人注目之处在于:
1)在目前的流行病中,我们面对的是一种以前未知的效率攻击人类细胞的病原体。
2)不仅是(上)呼吸道,内脏器官也受到攻击,有时功能严重受损。
因此,有必要问一问,冠状病毒如何能与人体细胞受体发生如此近乎完美的适应,以奠定未来大流行病的潜在危害。
下面将对冠状病毒大流行的前史进行详细的研究。由”武汉病毒学研究所”史正立领导的研究小组多年来在中国南方各省的洞穴中收集蝙蝠病毒,并将其带到武汉,在科学杂志上发表了大量的论文证明。然而,研究小组不仅对天然存在的冠状病毒进行了科学的研究,还刻意对冠状病毒进行了操作,目的是使冠状病毒的传染性更强,对人类的危害更大。”武汉病毒学研究所”的这一所谓”功能增益”研究,在同行评议的期刊上发表了多篇原创性的科学论文,多年来,许多科学界的代表都对这一研究持非常批评的态度。
在2013年发表在《自然》杂志上的一篇文章中[I.7],石正立和Peter Daszak领导的研究团队报道了冠状病毒冠状棱与人类ACE2细胞受体的成功对接。他们用中国云南省的马蹄鼻蝠作为SARS类冠状病毒的来源。本出版物的主要部分转载如下:
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《自然》503,第535-538页(2013年),发表于:2013年10月30日

利用ACE2受体的蝙蝠SARS样冠状病毒的分离和表征

Xing-Yi Ge, Jia-Lu Li, Xing-Lou Yang, Aleksei A. Chmura, Guangjian Zhu, Jonathan H. Epstein, Jonna K. Mazet, Ben Hu, Wei Zhang, Cheng Peng, Yu-Ji Zhang, Chu-Ming Luo, Bing Tan, Ning Wang, Yan Zhu, Gary Crameri, Shu-Yi Zhang, Lin-Fa Wang, Peter Daszak & Zheng-Li Shi

隶属机构
中国科学院武汉病毒学研究所病毒学国家重点实验室新发传染病中心,武汉,430071
Xing-Yi Ge, Jia-Lu Li, Xing-Lou Yang, Ben Hu, Wei Zhang, Cheng Peng, Yu-Ji Zhang, Chu-Ming Luo, Bing Tan, Ning Wang, Yan Zhu & Zheng-Li Shi
生态健康联盟,美国纽约,10001,纽约,美国
Aleksei A. Chmura, Guangjian Zhu, Jonathan H. Epstein & Peter Daszak
美国加州大学戴维斯分校兽医学院One Health Institute,95616,加州
Jonna K. Mazet
CSIRO澳大利亚动物健康实验室,澳大利亚维多利亚州吉朗,3220
Gary Crameri & Lin-Fa Wang
华东师范大学生命科学学院,上海 200062
Shu-Yi Zhang
新兴传染病项目,杜克-新加坡国立大学医学院研究生院,新加坡 169857
Lin-Fa Wang

摘要
2002-3年由严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)引起的大流行是近代史上最重大的公共卫生事件之一。中东呼吸综合征冠状病毒的持续爆发表明,这类病毒仍然是一个关键的威胁,而且其分布范围比以前认识的要广。虽然蝙蝠被认为是这两种病毒的天然储存库,但从蝙蝠中分离SARS-冠状病毒的祖先病毒的尝试一直没有成功。目前已报道了中国、欧洲和非洲的蝙蝠中的多种SARS样冠状病毒(SL-CoVs),但没有一种病毒被认为是SARS-CoV的直接祖先,因为它们的系统发育与SARS-CoV不一致,而且它们的钉状蛋白不能利用SARS-CoV的细胞受体分子–人血管紧张素转换酶II(ACE2)。在这里,我们报告了来自中国云南中国马蹄蝠(科:Rhinolophidae)的两种新型蝙蝠冠状病毒的全基因组序列,RsSHC014和Rs3367。这些病毒与SARS-CoV的关系远比以前发现的任何蝙蝠冠状病毒更密切,特别是在穗蛋白的受体结合域。最重要的是,我们报道了首次记录到从Vero E6细胞的蝙蝠粪便样品中分离出一种活的SL-CoV(蝙蝠SL-CoV-WIV1),该病毒具有典型的冠状病毒形态,与Rs3367的序列同一性为99.9%,并利用人类、果子狸和中国马蹄蝠的ACE2进入细胞。初步的体外试验表明,WIV1还具有广泛的物种适应性。我们的研究结果提供了迄今为止最有力的证据,证明中国马蹄蝠是SARS-CoV的天然贮藏库,一些蝙蝠SL-CoVs直接感染人类可能不需要中间宿主。他们还强调了针对新兴疾病热点地区的高危野生动植物群体病原体发现计划的重要性,以此作为大流行防范的策略。

主要内容
2002-3年大流行的SARS1和正在出现的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)表明,CoVs是一个重大的公共卫生威胁。SARS-CoV被证明使用人类ACE2分子作为其进入受体,这被认为是其跨物种传播性的标志。位于SARS-CoV穗(S)蛋白氨基末端区域(318-510个氨基酸)的受体结合域(RBD)直接参与与ACE2的结合。然而,尽管系统发育证据表明SARS-CoV是由蝙蝠SL-CoV演化而来的,但所有先前发现的SL-CoV在其S蛋白的RBD中都与SARS-CoV有重大的序列差异,包括一到两个缺失。用SARS-CoV S代替一个SL-CoV S蛋白的RBD,赋予了其利用人类ACE2并在小鼠中高效复制的能力。然而,迄今为止,还没有从蝙蝠中分离出SL-CoV,也没有证明蝙蝠来源的野生型SL-CoV能够使用ACE2。
我们在中国云南省昆明市的一个地点进行了为期12个月的SL-CoVs纵向调查(2011年4月至2012年9月)。使用之前公布的方法,从个体蝙蝠身上共采集了117份肛拭子或粪便样本。采用一步式反转录(RT)嵌套PCR法扩增RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)基因座A和C,这两个基因座在阿尔法新冠病毒和贝塔新冠病毒中是保守的。
117个样本中的27个(23%)被PCR列为阳性,随后通过测序确认。如前所述,通过细胞色素b序列分析,确认所有阳性样本的物种来源是R. sinicus16。在10月收集的样本中观察到的流行率(2011年为30%,2012年为48.7%)高于4月(2011年为7.1%)或5月(2012年为7.4%)。S蛋白RBD序列的分析表明,存在7个不同的SL-CoVs菌株。除了RBD序列与之前描述的SL-CoVs(Rs672、Rf1和HKU3)非常吻合外,还发现了两个新菌株(命名为SL-CoV RsSHC014和Rs3367)。测定了它们的全长基因组序列,发现它们的大小都是29787个碱基对(不包括聚(A)尾)。这两个基因组与人类SARS-CoV(Tor2株)的整体核苷酸序列同一性为95%,高于此前在中国(88-92%)或欧洲(76%)观察到的蝙蝠SL-CoV的序列同一性。这些新的SL-CoV与SARS-CoV在蛋白质水平上有较高的序列同一性。为了了解这两种新型SL-CoV菌株的进化起源,我们利用现有的蝙蝠SL-CoV菌株(Rf1、Rp3、Rs672、Rm1、HKU3和BM48-31)和人类及果子狸代表SARS-CoV菌株(BJ01、SZ3、Tor2和GZ02)的基因组序列,利用重组检测程序4.0软件包进行了重组分析。通过相似性图和bootscan分析,检测到了3个具有较强P值(<10-20)的断点。断点位于Rs3367(和RsSHC014)基因组的核苷酸20827、26553和28685处,并产生了覆盖核苷酸20827-26533的重组片段(5727个核苷酸)(包括部分开放阅读框(ORF)1b、全长S、ORF3、E和部分M基因)和26534-28685个核苷酸(2133个核苷酸)(包括部分ORF M、全长ORF6、ORF7、ORF8和部分N基因)。利用主亲区和次亲区的系统发育分析表明,Rs3367,即RsSHC014,是一个重组系的后代,最终导致SARS-CoV和SL-CoV Rs672。
这两个新的SL-CoVs和以前发现的SL-CoVs之间最显著的序列差异是在其S蛋白的RBD区域。首先,它们与SARS-CoV有较高的氨基酸序列同一性(RsSHC014和Rs3367分别为85%和96%)。其次,它们没有缺失,与SARS-CoV RBD区域具有完美的序列排列。结构和诱变研究此前已经发现SARS-CoV S蛋白RBD中的5个关键残基(442、472、479、487和491个氨基酸)在受体结合中具有关键作用。虽然发现RsSHC014 S蛋白中的5个残基都与SARS-CoV的残基不同,但Rs3367 RBD中的5个残基有两个是保守的。
尽管在过去的十年中,蝙蝠CoV序列迅速积累,但一直没有成功分离病毒的报告。我们尝试从SL-CoV PCR阳性样品中进行分离。使用优化的协议和Vero E6细胞,我们获得了一个分离物,在第二次盲传过程中引起细胞病变效应。纯化的病毒在电子显微镜下显示出典型的冠状病毒形态。为避免PCR诱导的污染,采用序列独立扩增法进行序列分析,表明该分离株与Rs3367几乎相同,核苷酸基因组序列同一性为99.9%,S1区氨基酸序列同一性为100%。新分离株被命名为SL-CoV-WIV1。
为了确定WIV1是否能利用ACE2作为细胞进入受体,我们用表达或不表达ACE2的人类、果子狸或中国马蹄蝠的HeLa细胞进行病毒感染性研究。我们发现,WIV1能够利用不同来源的ACE2作为进入受体,并在表达ACE2的细胞中高效复制。据我们所知,这是首次鉴定出能够利用ACE2作为进入受体的野生型蝙蝠SL-CoV。
为了评估其跨物种传播潜力,我们在一系列物种的细胞系中进行了感染性试验。我们的结果表明,蝙蝠SL-CoV-WIV1可以在人类肺泡基底上皮(A549)、猪肾15(PK-15)和马蹄蝠肾(RSKT)细胞系中生长,但不能在人类宫颈(HeLa)、叙利亚金仓鼠肾(BHK21)、Myotis davidii肾(BK)、Myotis chinensis肾(MCKT)、Rousettus leschenaulti肾(RLK)或Pteropus alecto肾(PaKi)细胞系中生长。实时RT-PCR表明,WIV1在A549、PK-15和RSKT细胞中的复制效率远低于在Vero E6细胞中的复制效率。
为了评估人SARS-CoV血清对WIV1的交叉中和活性,我们利用2003年收集的9名SARS患者的治疗血清进行了血清中和试验。结果显示,其中7份在1:10至1:40的稀释度下,能够完全中和100个组织培养感染剂量50(TCID50)的WIV1,进一步证实了WIV1与SARS-CoV之间的密切关系。
我们的发现对公共卫生有重要意义。首先,它们提供了SARS-CoV起源于蝙蝠的最明确证据。我们以前的工作提供了系统发育的证据,但直到现在,缺乏一个分离物或蝙蝠SL-CoVs可以自然感染人类细胞的证据,对这一假说产生了怀疑。其次,SL-CoVs缺乏利用ACE2受体的能力,此前一直被认为是其直接溢出到人类的关键障碍,支持了在SARS爆发期间,狸猫是SARS-CoV适应人类传播的中间宿主的观点。然而,SL-CoV-WIV1能够利用人类的ACE2,这说明SL-CoV-WIV1没有必要进行这一步骤,并表明蝙蝠直接感染人是某些蝙蝠SL-CoV的可行方案。这对公共卫生控制措施有影响,因为最近发现的类似SARS的CoVs种类繁多,而且不断增加,地理分布广泛,可能会出现蔓延。
我们的研究结果表明,蝙蝠CoVs的多样性大大高于以前的报道。在这项研究中,我们能够证明至少有7个不同的SL-CoVs菌株在12个月的时间内,在R. sinicus的一个菌落内循环。SL-CoVs在这个菌落内的高遗传多样性反映了不同菌株对ACE2的不同使用的高表型多样性。因此,如果进一步监测发现能够使用ACE2的蝙蝠SL-CoV具有广泛的多样性,其中一些可能与SARS-CoV比SL-CoV-WIV1的同源性更近,也就不足为奇了。我们的结论–除了最近在沙特阿拉伯蝙蝠中发现的MERS-CoV,以及在中国、非洲、欧洲和北美发现的与MERS-CoV密切相关的蝙蝠CoV之外,还表明蝙蝠冠状病毒仍然是对公共健康的重大全球威胁。
最后,这项研究表明了针对野生动物的病原体发现计划在公共卫生方面的重要性,该计划旨在确定”已知的未知物”–与已知病原体密切相关的先前未知的病毒株。这些计划侧重于特定的高风险野生动物群体和疾病出现的热点地区,可能是未来预测、准备和预防大流行病出现的全球战略的重要组成部分。
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“武汉病毒学研究所”等同事对这项工作的评价如下[I.12]。
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评论在以下文章中:
Virol. Sin. 28(6), 315 (2013), doi: 10.1007/s12250-013-3402-x.

蝙蝠作为SARS冠状病毒的动物储备库:经过10年的病毒猎杀证明了这一假设

Manli Wang , Zhihong Hu

隶属机构

中国科学院武汉病毒学研究所病毒学国家重点实验室,武汉,430071。

概要
近日,中国科学院武汉病毒研究所石正丽博士和生态健康联盟Peter Daszak博士领导的团队在中国马蹄蝠中发现了与人类SARS-CoV95%相同的SL-CoV,并能利用人类血管紧张素转换酶2(ACE2)受体进行对接和进入。值得注意的是,他们分离出了第一个已知的活的蝙蝠SL-CoV,可以在人类和相关细胞中复制。他们的研究结果提供了明确的证据,证明在蝙蝠中循环的一些SL-CoVs能够在人类中感染和复制(Ge X Y,等,2013)。严重急性呼吸道综合征(SARS)是新千年的第一次大流行。它于2002年11月在中国南方开始流行,已波及33个国家,造成8096人感染,774人死亡(死亡率为9.6%),同时造成巨大的经济损失。SARS的病原体被确定为一种新型冠状病毒(SARS-CoV)(Drosten C,等,2003;Ksiazek T G,等,2003)。然而,SARS-CoV的起源仍然难以捉摸。虽然有人认为蝙蝠是SARS-CoV的天然储存库,但从蝙蝠中分离出类似SARS的病毒(SL-CoV)一直没有成功。为了追溯突然出现的SARS-CoV的来源,不同的研究小组进行了分子流行病学研究。2003年,Guan等人从中国广东某活体动物市场的喜马拉雅棕榈狸和其他两种动物身上分离出SARS-CoV(Guan Y,等,2003)。中国SARS分子流行病学联盟认为,早期人类SARS-CoV菌株可能来源于野生动物(中国SARS分子流行病学联盟,2004)。这些证据和其他证据表明,棕榈狸是直接来源,因为从狸类中分离出来的菌株与2002-3和2003-4年SARS大流行中的人类分离菌株高度相关(Guan Y,等,2013;Song H D,等,2005;Wang M,等,2005)。自2004年以来,包括石博士实验室在内的多个研究小组从蝙蝠中鉴定出了SL-CoVs(Li W,2005;Lau S K,et al,2005)。这些蝙蝠分离物的遗传多样性更强,与人类或狸类的SARSCoV有88%-92%的核苷酸同一性,从而推测蝙蝠可能是SARS-CoV的天然宿主。然而,之前从蝙蝠中鉴定的SL-CoVs与2002-3年爆发的SARS-CoV之间仍有一些缺失的联系。1)尽管整体基因组序列相似,但之前已知的SL-CoV与SARS-CoV之间的穗(S)蛋白存在显著差异。S1的序列同一性下降到64%,伴随着该区域的插入和(或)突变。S1含有受体结合域(RBD),它在受体识别中起着关键作用,是决定SARSCoV宿主范围和跨物种感染的主要因素。有研究认为,由于蝙蝠的RBDs存在显著差异,此前已知的蝙蝠SL-CoV染色体不能从蝙蝠跳到狸猫或人类身上(Li F,2013);2)虽然已经从不同种类的蝙蝠中鉴定出SL-CoV,但从未成功从蝙蝠中分离出一个活的SL-CoV;3)没有来自蝙蝠的原生SL-CoV能够利用ACE2作为受体并感染人体细胞,只有当其RBD被人类SARS-CoV菌株的对应物所替代时,才有可能感染人体细胞(Li W,等,2003;Becker M M,等,2008;Ren W,等,2008)。因此,这些SL-CoVs似乎不太可能是果子狸或人类SARS-CoVs的直接前体(Li F,2013)。
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两年后,石正丽和Ralph Baric领导的研究小组的另一篇文章发表在《自然医学》杂志上,证明对马蹄鼻蝠的冠状病毒进行遗传修饰后,会产生新的人工生成的”杂交病毒”,可以特别高效地与人类呼吸道细胞进行配对[I.8]。在这项工作中,研究人员创造了一种”嵌合体”病毒,由一种名为SHC014的蝙蝠病毒的表面蛋白和SARS冠状病毒的骨干组成。该嵌合病毒感染了人类呼吸道细胞,并提供了证据表明SHC014的表面蛋白具有必要的结构,可以非常有效地结合并感染一个关键的人类细胞受体。本出版物的主要部分转载如下:
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自然医学 21,第1508-1513页(2015年),出版日期:2015年11月9日

一个类似SARS的循环蝙蝠冠状病毒群显示对于出现在人类身上的可能性

Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi & Ralph S Baric

隶属机构
美国北卡罗来纳大学教堂山分校流行病学系,美国北卡罗来纳州教堂山
Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Eric F Donaldson & Ralph S Baric
美国北卡罗来纳大学教堂山分校微生物学和免疫学系,美国北卡罗来纳州教堂山
Kari Debbink & Ralph S Baric
美国阿肯色州杰弗逊市食品和药物管理局国家毒理学研究中心
Sudhakar Agnihothram
中国科学院武汉病毒学研究所特殊病原体与生物安全重点实验室,武汉
Xing-Yi Ge & Zhengli-Li Shi
美国北卡罗来纳大学教堂山分校细胞生物学和生理学系,美国北卡罗来纳州教堂山
Scott H Randell
美国北卡罗来纳大学教堂山分校Marsico肺部研究所囊性纤维化中心,美国北卡罗来纳州教堂山
Scott H Randell
瑞士苏黎世Bellinzona微生物研究所生物医学研究所
Antonio Lanzavecchia
美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院Dana-Farber癌症研究所癌症免疫学和艾滋病系
Wayne A Marasco
美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学系
Wayne A Marasco

概要
严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸道综合征(MERS)-CoV的出现,凸显了跨物种传播事件导致人类爆发的威胁。在此,我们研究了一种SARS样病毒SHC014-CoV的疾病潜力,该病毒目前在中国马蹄蝠种群中流通。利用SARS-CoV反向遗传学系统,我们生成并鉴定了一种在小鼠适应SARS-CoV骨架中表达蝙蝠冠状病毒SHC014尖峰的嵌合病毒。结果表明,在野生型骨架中编码SHC014穗的2b组病毒可以有效利用SARS受体人血管紧张素转化酶II(ACE2)的多个正交体,在原代人呼吸道细胞中高效复制,并在体外达到与SARS-CoV流行株相当的滴度。此外,体内实验证明该嵌合病毒在小鼠肺部的复制具有显著的致病性。对现有的基于SARS的免疫治疗和预防方式的评估显示疗效不佳;单克隆抗体和疫苗方法都不能中和和保护使用新型穗蛋白的CoVs感染。在这些发现的基础上,我们合成重新衍生了一种具有感染性的全长SHC014重组病毒,并在体外和体内展示了强大的病毒复制能力。我们的工作表明,目前在蝙蝠种群中流通的病毒存在SARS-CoV再次出现的潜在风险。
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这些实验是建立在2008年和2010年武汉石正丽的研究小组已经在《病毒学杂志》上发表的工作基础上的([I.5], [I.6]),在这些工作中,已经可以证明如何利用基于HIV的伪病毒使病毒经过基因修饰后的特异性感染人体细胞。这两份出版物的主要内容转载如下:
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《病毒学杂志》,2008年2月,p. 1899–1907 Vol. 82, No. 4, DOI: 10.1128/JVI.01085-07

蝙蝠起源的严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒和SARS样冠状病毒之间受体应用的差异

Wuze Ren(1)†, Xiuxia Qu(2)†, Wendong Li(1)‡, Zhenggang Han(1), Meng Yu(3), Peng Zhou(1), Shu-Yi Zhang(4), Lin-Fa Wang(3), Hongkui Deng(2) and Zhengli Shi(1)

1)中国科学院武汉病毒学研究所病毒学国家重点实验室,武汉
2)北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室
3)CSIRO畜牧业、澳大利亚动物卫生实验室和澳大利亚新兴传染病生物安全合作研究中心
4)上海华东师范大学生命科学学院,ChinaWuze Ren, Xiuxia

摘要
严重急性呼吸道综合症(SARS)是由SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)引起的,它利用血管紧张素转换酶2(ACE2)作为其受体进入细胞。在马蹄蝠身上发现了一组SARS样CoVs(SL-CoVs)。SL-CoVs和SARS-CoVs具有相同的基因组组织和较高的序列一致性,主要的例外是穗蛋白(S)的N端,已知穗蛋白负责CoVs中的受体结合。在这项研究中,我们通过将基于人类免疫缺陷病毒的伪病毒系统与表达人类、狸猫或马蹄蝠的ACE2分子的细胞系相结合,研究了SL-CoV S的受体用途。除了SL-CoV和SARS-CoV的全长S外,通过将SARS-CoV S的不同序列插入SL-CoV S骨架中,构建了一系列S嵌合体。从这项研究中得到了几个重要的观察结果。首先,SL-CoV S无法使用三个ACE2分子中的任何一个作为其受体。第二,SARS-CoV S未能进入表达蝙蝠ACE2的细胞。第三,覆盖之前定义的受体结合域的嵌合S,获得了通过人类ACE2进入细胞的能力,尽管不同构建体的效率不同。第四,发现一个最小的插入区域(310~518个氨基酸)足以使SL-CoV S从非ACE2结合转化为人类ACE2结合,表明SL-CoV S在结构和功能上与SARS-CoV S蛋白基本兼容。讨论了这些发现与病毒来源、病毒重组和宿主转换的意义。
2002-2003年爆发的严重急性呼吸道综合症(SARS),导致8000多人感染,近800人死亡,是由一种新型冠状病毒(CoV)引起的,现在称为SARS相关CoV(SARS-CoV)。在中国广东的一个活体动物市场上,在几只喜马拉雅棕榈狸(Paguma larvata)和一只浣熊犬(Nyctereutes procyonoides)中分离并鉴定出了关系非常密切的病毒,首次发现了SARS-CoV与动物的关联。来自果子狸的SARS-CoV样病毒与来自人类的SARS-CoV之间存在非常高的基因组序列同一性(超过99%),支持SARS-CoV来源于动物的观点。然而,随后的研究表明,农场和野外的棕榈狸基本上没有感染SARS-CoV。这些结果表明,果子狸扮演了一个中间宿主的角色,而不是作为一个天然的储存库。随后在不同蝙蝠种群中进行的监测研究发现,在几个马蹄蝠种群(Rhinolophus属)中存在一组多样化的CoVs,它们在基因组组织和序列上与SARS-CoV非常相似。这些病毒被命名为SARS样CoVs(SL-CoVs)或SARS-CoV样病毒。这些发现提出了蝙蝠是SARS-CoV的天然储存库的可能性,并引发了在不同地理位置的不同蝙蝠物种中寻找CoV的热潮。
基于不同蛋白序列的系统发育分析表明,在蝙蝠中发现的SL-CoVs和来自人类及狸类的SARS-CoVs应该放在CoV第2组(G2b)的一个单独的亚组(b组)中,以区别于冠状病毒属的其他第2组CoVs。G2b组CoVs在其S蛋白的N端区域表现出主要的序列差异。CoVs的S蛋白在病毒进入宿主细胞的过程中起着关键作用,包括与宿主细胞受体结合和膜融合。血管紧张素转换酶2(ACE2)已被确定为SARS-CoV的功能受体,ACE2与SARS-CoV S蛋白之间的分子相互作用已被很好地表征。在SARS-CoV S蛋白中的一个193个碱基片段(氨基酸[aa]318至510)被证明是最小受体结合域(RBD),它能够单独与ACE2有效结合。此外,研究表明,SARS-CoV S蛋白的受体结合基团(RBM)氨基酸残基的微小变化可以废除SARS-CoV进入表达人ACE2(huACE2)的细胞。在SL-CoV S蛋白相应的RBD区域,与SARS-CoV S蛋白的序列有明显的分歧,包括两个5和12或13 aa的缺失。通过对S-ACE2复合物的晶体结构分析,预测SL-CoV的S蛋白不太可能使用huACE2作为进入受体,不过由于缺乏活的SL-CoV分离物,这一点一直没有得到实验证明。是否有可能用SARS-CoV S蛋白中的RBD代替ACE2结合的SL-CoV S蛋白也是未知数。
在这项研究中,我们采用了基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的伪病毒系统来解决这些问题。我们的研究结果表明,SL-CoV S蛋白无法利用不同物种的ACE2蛋白进入细胞,SARS-CoV S蛋白也无法结合马蹄蝠(Rhinolophus pearsonii)的ACE2分子。然而,当把SL-CoV S的RBD换成SARS-CoV S的RBD时,混合S蛋白能够利用huACE2进入细胞,这意味着SL-CoV S蛋白在结构和功能上与SARS-CoV S非常相似。这些结果表明,虽然目前在蝙蝠中发现的SL-CoV不太可能利用ACE2作为受体感染人类,但它们是否能够利用某些人类细胞类型的其他表面分子进入细胞还有待观察。还可以想象,如果这些病毒发生N端序列变异,例如,通过与其他CoVs重组,可能会对人类产生感染性,进而与ACE2或人类细胞上的其他表面蛋白产生有效的相互作用。
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《病毒学档案》155(10), 1563–1569 (2010)

在线发表于2010年6月22日。 doi: 10.1007/s00705-010-0729-6

不同蝙蝠物种的血管紧张素转换酶2(ACE2)蛋白赋予SARS-CoV进入的易感性

Yuxuan Hou, Cheng Peng, Meng Yu, Yan Li, Zhenggang Han, Fang Li, Lin-Fa Wang & Zhengli Shi

中国科学院武汉病毒学研究所病毒学国家重点实验室,湖北武汉。

摘要
在蝙蝠中发现类似SARS的冠状病毒表明,蝙蝠可能是SARS-CoV的天然库。然而,之前的研究表明,来自马蹄蝠的血管紧张素转换酶2(ACE2)蛋白,一种已知的SARS-CoV受体,无法作为SARS-CoV的功能性受体。在这里,我们将之前的研究扩展到来自另外7种蝙蝠的ACE2分子,并使用基于HIV的假型和活的SARS-CoV感染试验测试它们与人类SARS-CoV穗蛋白的相互作用。结果表明,达本托尼蝙蝠(Myotis daubentoni)和犀牛蝙蝠(Rhinolophus sinicus)的ACE2支持SARS-CoV S蛋白介导的病毒进入,尽管与人类ACE2的效率相比有所不同。此外,正如对不同蝙蝠ACE2分子的结构建模研究所预测的那样,几个关键残基的改变要么降低要么提高了蝙蝠ACE2受体的效率。这些数据表明,M. daubentoni和R. sinicus很可能是SARS-CoV的易感者,可能是SARS-CoV原病毒的自然宿主。此外,我们目前的研究还表明,蝙蝠中ACE2的遗传多样性大于在已知的SARS-CoV易感哺乳动物中观察到的多样性,这凸显了还有更多未被描述的蝙蝠物种可以作为SARS-CoV或其祖先病毒的储存库的可能性。这就需要继续并扩大对不同蝙蝠种群的实地监测研究,以最终确定真正的SARS-CoV天然储存库。

介紹
严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)是导致2002-2003年SARS爆发的病原体,对公共卫生、旅游和世界经济产生了巨大的全球影响[4,11]。SARS-CoV的宿主范围很大程度上取决于SARS-CoV穗蛋白上确定的受体结合域(RBD)与其宿主受体血管紧张素转化酶2(ACE2)之间的特异性和高亲和力相互作用[6,7,9]。据推测,SARS-CoV在其自然库–蝙蝠中被窝藏,并由蝙蝠直接或间接地传播给棕榈狸,然后再传播给人类[10]。然而,虽然在犀牛属的马蹄蝠中发现了遗传相关的SARS样冠状病毒(SL-CoV)[5,8,12,18],但其穗蛋白不能利用人ACE2(hACE2)蛋白作为受体[13]。仔细研究人SARS-CoV RBD与hACE2复合物的晶体结构表明,SL-CoV穗蛋白的受体结合基团(RBM)区的截断取消了其与hACE2结合的能力[7,10],因此最近在马蹄蝠中发现的SL-CoV不太可能是人SARS-CoV的直接祖先。另外,有研究表明,人SARS-CoV穗蛋白及其密切相关的狸SARS-CoV穗蛋白不能利用马蹄蝠(R. pearsoni)的ACE2作为受体[13],凸显了SARS-CoV在蝙蝠-狸/人传播链中缺失的关键环节。
至少有三种可能的情况可以解释SARS-COV的起源。第一,一些未知的中间宿主负责SARS-CoV从蝙蝠到狸猫或人类的适应和传播。这是目前最流行的SARS-CoV传播理论[10]。第二,在非蝙蝠动物宿主中存在一种与SARS-CoV暴发株关系非常密切的SL-CoV,能够从水库宿主直接传播给人类或狸猫。第三,来自尚未确定的蝙蝠物种的ACE2可能作为一个有效的受体,这些蝙蝠可能是人类或狸猫SARS-CoV的直接贮藏者。揭开2002-2003年SARS疫情中最有可能发生的是哪种情况,对于我们了解疫情的动态至关重要,并将在帮助我们预防未来疫情的发生方面发挥关键作用。为此,我们将研究范围扩大到包括不同种类蝙蝠的ACE2分子,并研究它们与人类SARS-CoV尖峰蛋白的相互作用。结果表明,蝙蝠ACE2分子之间存在很大的遗传多样性,特别是在与病毒穗蛋白相互作用的关键残基上,湖北省的Miotis daubentoni和Rhinolophus sinicus的ACE2可以支持病毒进入。
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随后,科学家们就对从这种实验中获得的知识能否证明大流行病的潜在风险的合理性展开了激烈的辩论。巴黎巴斯德研究所的一位著名病毒学家指出,武汉研究所的研究人员创造了一种新型病毒,这种病毒在人体细胞中的复制效果非常好,他还说:”如果病毒逃逸,没有人能够预测它将如何传播。”一位分子生物学家补充说:”这项研究的唯一意义是创造了一种基于实验室的、新的、非自然的威胁。”当时的争论被许多期刊和媒体的文章所关注和评论。以下是两个例子([III.2]、[III.5])。
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《自然》(2015), doi:10.1038/自然.2015.18787

自然|新闻

工程化蝙蝠病毒引发风险研究的辩论

实验室制造的与SARS有关的冠状病毒可以感染人体细胞。

Declan Butler

一项实验创造了一种蝙蝠冠状病毒的混合版本–与导致SARS(严重急性呼吸道综合征)的病毒有关–引发了关于具有大流行病潜力的病毒工程实验室变种是否值得冒险的再次辩论。
11月9日,科学家在《自然医学》杂志上发表文章,对一种名为SHC014的病毒进行了研究,这种病毒在中国的马蹄蝠身上发现。研究人员创造了一种嵌合体病毒,由SHC014的表面蛋白和SARS病毒的骨干组成,该病毒已经被改造成在小鼠体内生长,并模仿人类疾病。该奇马病毒感染了人类气道细胞–证明SHC014的表面蛋白具有与细胞上的关键受体结合并感染细胞的必要结构。它也使小鼠患病,但没有杀死它们。
虽然几乎所有从蝙蝠中分离出来的冠状病毒都无法与关键的人类受体结合,但SHC014并不是第一个能够做到这一点的病毒。2013年,研究人员首次报道了从同一蝙蝠群体中分离出的不同冠状病毒的这种能力。
研究人员说,研究结果加强了对能够直接感染人类的蝙蝠冠状病毒(而不是首先需要在中间动物宿主中进化)的怀疑,可能比以前认为的更为普遍。
但其他病毒学家质疑从实验中收集到的信息是否能证明潜在风险的合理性。虽然任何风险的程度都很难评估,但巴黎巴斯德研究所的病毒学家Simon Wain-Hobson指出,研究人员创造了一种新型病毒,它在人类细胞中 “生长得非常好”。他说:”如果病毒逃逸,没有人能够预测其轨迹”。

创造一个chimaera
这场争论本质上是关于是否允许实验室研究增加危险病原体的毒力、易于传播或宿主范围的争论的重演–即所谓的”功能增益”研究。2014年10月,美国政府暂停了对导致SARS、流感和MERS(中东呼吸综合征,一种由病毒引起的致命疾病,它从骆驼身上零星地跳到人身上)的病毒的这类研究的联邦资助。
最新的研究在美国暂停令开始之前就已经在进行了,美国国立卫生研究院(NIH)允许它继续进行,而它正在接受该机构的审查,北卡罗来纳大学教堂山分校的传染病研究员Ralph Baric说,他是这项研究的共同作者。美国国立卫生研究院最终得出的结论是,这项工作并不是风险太大,以至于属于暂停的范围,他说。
但Wain-Hobson不赞成这项研究,因为他说,它几乎没有提供什么好处,并且几乎没有揭示蝙蝠中的野生SHC014病毒对人类构成的风险。
研究中的其他实验表明,野生蝙蝠中的病毒需要进化才能对人类构成任何威胁–虽然不能排除这种情况,但这种变化可能永远不会发生。巴里奇和他的团队从其基因组序列中重建了野生病毒,发现它在人类细胞培养物中生长不良,在小鼠中没有引起重大疾病。
“这项工作的唯一影响是在实验室里创造了一种新的、非自然的风险,”新泽西州皮斯卡塔韦的罗格斯大学的分子生物学家和生物防御专家理查德-埃布莱特同意这种观点。Ebright和Wain-Hobson都是功能增益研究的长期批评者。
在他们的论文中,研究作者也承认,资助者可能会在未来允许此类实验时三思而行。他们写道:”科学审查小组可能会认为基于循环菌株构建嵌合病毒的类似研究风险太大,无法继续进行。”他们补充说,需要讨论 “这些类型的嵌合病毒研究是否值得进一步调查与所涉及的固有风险”。
但巴里奇和其他人说,这项研究确实有好处。2013年论文的共同作者彼得-达斯扎克说,研究结果”使这种病毒从一种候选的新兴病原体变成了一种明确的现时危险”。达斯扎克是”生态健康联盟”的主席,该联盟是一个国际科学家网络,总部设在纽约市,对全球新兴疾病热点地区的动物和人进行病毒采样。
Daszak同意,在人类细胞培养和动物模型中测试杂交病毒的研究,在它们能说明野生病毒构成的威胁方面是有限的。但他认为,这些研究可以帮助说明哪些病原体应该优先得到进一步的研究关注。
巴里奇说,如果没有这些实验,SHC014病毒仍将被视为不构成威胁。此前,科学家根据分子模型和其他研究认为,它应该无法感染人体细胞。他说,最新的工作表明,该病毒已经克服了关键的障碍,比如能够吸附在人类受体上,有效地感染人类气道细胞。”我认为你不能忽视这一点。”他计划在非人类灵长类动物中对该病毒进行进一步研究,这可能会产生与人类更相关的数据。
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《科学家》,11月16日(2015年)

实验室制造冠状病毒引发讨论

一种类似SARS病毒的嵌合体病毒的产生使科学家们讨论功能增益研究的风险。

Jef Akst

北卡罗来纳大学教堂山分校的传染病研究员Ralph Baric上周(11月9日)发表了一项研究,他的团队努力设计出一种病毒,该病毒具有中国马蹄蝠中发现的SHC014冠状病毒的表面蛋白和导致小鼠类人类严重急性呼吸道综合征(SARS)的骨干。根据该团队发表在《自然医学》上的成果,该杂交病毒可以感染人类气道细胞,并在小鼠身上致病。
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尽管这种有时非常激烈的争论和众多科学界代表发出了世界性大流行的警告,但”武汉病毒学研究所”石正丽小组与Peter Daszak合作,继续进行着他们对转基因冠状病毒的高风险研究,以下两篇2017年和2018年的论文([I.9]、[I.10])就是证明。他们使用的是已经建立多年的遗传操作方法,从论文[1.10]中可以看出:
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PLoS Pathog 13(11): e1006698. https://doi.org/10.1371/ journal.ppat.1006698

编辑:德国柏林Charité大学医学院Christian Drosten
收稿日期:2017年2月10日;接收:2017年10月17日;发表:2017年11月30日

研究文章

发现丰富的蝙蝠SARS相关冠状病毒基因库,为了解SARS冠状病毒的来源提供了新的认识

Ben Hu, Lei-Ping Zeng, Xing-Lou Yang, Xing-Yi Ge, Wei Zhang, Bei Li, Jia-Zheng Xie, Xu-Rui Shen, Yun-Zhi Zhang, Ning Wang, Dong-Sheng Luo, Xiao-Shuang Zheng, Mei-Niang Wang, Peter Daszak, Lin-Fa Wang, Jie Cui and Zheng-Li Shi

中科院特殊病原体与生物安全重点实验室,中国科学院武汉病毒研究所新发传染病中心,武汉;
云南省地方病防治研究所,大理;
大理大学,大理,中国;
生态健康联盟,美利坚合众国纽约州纽约市;
新加坡杜克-新加坡国立大学医学院新发传染病课程

摘要
自2005年以来,中国不同地区在马蹄蝠身上发现了大量SARS相关冠状病毒(SARSr-CoV)。然而,这些蝙蝠SARSr-CoV与SARS冠状病毒(SARS-CoV)在不同基因(S、ORF8、ORF3等)上存在序列差异,被认为不太可能代表SARS-CoV的直接祖先。在此,我们报告了在中国云南省一个多种类马蹄蝠栖息的洞穴中对SARSr-CoVs进行5年监测的结果。新发现的11个SARSr-CoV菌株的全长基因组,加上我们以前的研究结果,发现在这个单一地点循环的SARSr-CoVs在S基因、ORF3和ORF8上具有高度多样性。重要的是,在这个洞穴中都发现了分别在S1基因的超变N端域(NTD)和受体结合域(RBD)、ORF3和ORF8区域与SARS-CoV具有高度遗传相似性的菌株。此外,我们还报道了在ORF3b和分裂的ORF8a和8b中首次发现了与人类SARS-CoV高度相似的蝙蝠SARSr-CoV。此外,与其他地方检测到的SARSr-CoV株相比,该洞穴的SARSr-CoV株在非结构蛋白基因ORF1a和1b中与SARS-CoV的关系更为密切。重组分析显示,有证据表明这些SARSr-CoV之间在S基因内和ORF8周围频繁发生重组事件。我们推测SARS-CoV的直接祖先可能起源于这些SARSr-CoV的前体之间的连续重组事件之后。细胞进入研究表明,新发现的3种具有不同S蛋白序列的SARSr-CoV均能以人类ACE2为受体,进一步展示了该洞穴中的菌株与SARS-CoV之间的密切关系。这项工作为SARS-CoV的起源和进化提供了新的认识,并强调了对未来出现的SARS类疾病的防范的必要性。

作者摘要
在过去的十年里,越来越多的证据支持SARS冠状病毒(SARS-CoV)来源于蝙蝠。然而,目前已知的蝙蝠SARSr-CoVs没有一个被认为是SARS-CoV的直接祖先。在此,我们报告了在中国云南的一个洞穴中鉴定了一组不同的蝙蝠SARSr-CoVs。重要的是,SARS-CoV基因组的所有构建模块,包括高度可变的S基因、ORF8和ORF3,都可以在这个单一地点的不同SARSr-CoV菌株的基因组中找到。根据对新发现的蝙蝠SARSr-CoVs全长基因组序列的分析,我们推测SARS-CoVs的直接祖先可能是由这些蝙蝠SARSr-CoVs的前体在溢出到中间宿主之前的连续重组事件产生的。此外,我们还发现具有不同S蛋白的蝙蝠SARSr-CoV菌株都能利用SARS-CoV在人类中的受体(ACE2)进行细胞进入,这说明在这个洞穴中的蝙蝠中循环着能够直接传播给人类的多样化SARSr-CoV。因此,我们目前的研究为SARS-CoV的进化起源提供了更清晰的图像,并强调了未来出现SARS类疾病的风险。
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《自然》第556卷,第255-258页(2018年)

由香港大学2型蝙蝠冠状病毒引起的致命猪急性腹泻综合症

Peng Zhou, Hang Fan, Tian Lan, Xing-Lou Yang, Wei-Feng Shi, Wei Zhang, Yan Zhu, Ya-Wei Zhang, Qing-Mei Xie, Shailendra Mani, Xiao-Shuang Zheng, Bei Li, Jin-Man Li, Hua Guo, Guang-Qian Pei, Xiao-Ping An, Jun-Wei Chen, Ling Zhou, Kai-Jie Mai, Zi-Xian Wu, Di Li, Danielle E. Anderson, Li-Biao Zhang, Shi-Yue Li, Zhi-Qiang Mi, Tong-Tong He, Feng Cong, Peng-Ju Guo, Ren Huang, Yun Luo, Xiang-Ling Liu, Jing Chen, Yong Huang, Qiang Sun, Xiang-Li-Lan Zhang, Yuan-Yuan Wang, Shao-Zhen Xing, Yan-Shan Chen, Yuan Sun, Juan Li, Peter Daszak, Lin-Fa Wang, Zheng-Li Shi, Yi-Gang Tong & Jing-Yun Ma

隶属机构
中科院特殊病原体与生物安全重点实验室,中国科学院武汉病毒研究所,武汉
Peng Zhou, Xing-Lou Yang, Wei Zhang, Yan Zhu, Xiao-Shuang Zheng, Bei Li, Hua Guo, Yun Luo, Xiang-Ling Liu, Jing Chen & Zheng-Li Shi
北京微生物与流行病学研究所,北京,中国
Hang Fan, Ya-Wei Zhang, Jin-Man Li, Guang-Qian Pei, Xiao-Ping An, Zhi-Qiang Mi, Tong-Tong He, Yong Huang, Qiang Sun, Xiang-Li-Lan Zhang, Yuan-Yuan Wang, Shao-Zhen Xing & Yi-Gang Tong
华南农业大学动物科学学院,广州,中国
Tian Lan, Qing-Mei Xie, Jun-Wei Chen, Ling Zhou, Kai-Jie Mai, Zi-Xian Wu, Di Li, Yan-Shan Chen, Yuan Sun & Jing-Yun Ma
广州市动物卫生水产养殖与环境控制重点实验室
Tian Lan, Qing-Mei Xie, Jun-Wei Chen, Ling Zhou, Kai-Jie Mai, Zi-Xian Wu, Di Li, Yan-Shan Chen, Yuan Sun & Jing-Yun Ma
泰安市泰山医学院山东高校新发传染病病原学与流行病学重点实验室
Wei-Feng Shi & Juan Li
新加坡杜克-新加坡国立大学医学院新兴传染病课程,新加坡,新加坡
Shailendra Mani, Danielle E. Anderson & Lin-Fa Wang
广东省动物保护与资源利用重点实验室,
广东省野生动物保护与利用公共实验室,
广东省生物资源应用研究所,广州,中国
Li-Biao Zhang
武汉大学公共卫生学院,武汉
Shi-Yue Li
广东省实验动物监测所广东省重点实验室,广州
Feng Cong, Peng-Ju Guo & Ren Huang
美国纽约州纽约市生态健康联盟
Peter Daszak
华北科技大学生命科学学院,唐山
Yi-Gang Tong

摘要
野生动物病毒库中的病毒跨物种传播对人类和动物健康构成明显威胁。蝙蝠已被公认为是新出现的病毒最重要的宿主之一,一种起源于蝙蝠的冠状病毒通过中间宿主传播给人类,是造成影响巨大的新出现的人畜共患病–严重急性呼吸道综合征(SARS)的原因。在此,我们提供了病毒学、流行病学、进化和实验证据,证明一种与香港大学2号相关的新型蝙蝠冠状病毒–猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是导致中国猪只大规模爆发致命疾病的病原体,该疾病已导致4个猪场的24,693头仔猪死亡。值得注意的是,该疫情始于广东省,在SARS大流行的原产地附近。此外,我们在2013-2016年期间从广东省采集的蝙蝠肛门拭子中,在9.8%(591个中的58个)中发现了序列同一性为96-98%的SADS相关CoVs,主要是马蹄蝠(Rhinolophus spp.),而马蹄蝠是已知的SARS相关CoVs的储存地。我们发现,SADS和SARS的爆发在地理、时间、生态和病原学环境上有惊人的相似性。这项研究强调了确定蝙蝠中冠状病毒多样性和分布的重要性,以减轻未来可能威胁牲畜、公共卫生和经济增长的爆发。

方法
样品收集
如前所述,在广东省的自然栖息地捕获蝙蝠并进行采样。粪便拭子样品在病毒运输培养基(VTM)中采集,该培养基由Hank’s平衡盐溶液组成,pH值为7.4,含有BSA(1%)、两性霉素(15μg ml-1)、青霉素G(100单位ml-1)和链霉素(50μg ml-1)。在VTM中收集病猪的粪便样品。在适当和可行的情况下,还从死亡的动物身上采集肠道样品。将样品等分,在-80℃下保存,直至使用。从康复母猪和与病猪有密切接触的猪场工人身上采集血液样本。血清在采集后24小时内以3000g离心分离15分钟,在4℃下保存。人血清采集经武汉大学公共卫生学院医学伦理委员会和蜂鸟IRB批准。人、猪和蝙蝠的采样没有性别或年龄偏好,除非有说明(如仔猪或母猪)。没有使用统计方法来预先确定样本量。

人类和猪基因的扩增、克隆和表达
人类ACE2在pcDNA3.1中的表达克隆的构建之前已经描述过(Ge,X.Y.等人: 使用ACE2受体的蝙蝠SARS样冠状病毒的分离和特性。Nature 503, 535-538 (2013) and Ren, W. et al: 严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒和蝙蝠源SARS样冠状病毒之间受体使用的差异。J. Virol. 82, 1899–1907 (2008))。从人类细胞系中扩增出人类DPP4。人APN(也称为ANPEP)是商业合成的。猪APN(也称为ANPEP)、DPP4和ACE2从仔猪肠道中扩增。使用特异性引物(根据要求提供)扩增全长基因片段。人ACE2被克隆到pCDNA3.1中,并与His标签融合。人APN和DPP4、猪APN、DPP4和ACE2被克隆到与S标签融合的pCAGGS中。将纯化的质粒转染到HeLa细胞中。24小时后,使用小鼠抗His标记或小鼠抗S标记单克隆抗体(内部生产),然后用Cy3标记的山羊抗鼠/兔IgG(Proteintech集团)进行免疫荧光检测,确认HeLa细胞中人或猪基因的表达。

伪病毒的制备
将克隆到pcDNA3.1中的SADS-CoV或MERS-CoV的密码子人源化S基因用于假病毒的构建,如前所述(Ge,X.Y.等: 利用ACE2受体的蝙蝠SARS样冠状病毒的分离和鉴定。Nature 503, 535-538 (2013) and Ren, W. et al: 严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒和蝙蝠源SARS样冠状病毒之间受体使用的差异。J. Virol. 82, 1899–1907 (2008)). 简而言之,使用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)将每个pHIV-Luc质粒(pNL4.3.Luc.R-E-Luc)和S-蛋白表达质粒(或空载体对照)的15μg共转染到4×106 HEK293T细胞中。4小时后,用新鲜培养基替换培养基。转染48小时后收集上清液,在3000g离心澄清,然后通过0.45μm的过滤器(Millipore)。过滤后的上清液在-80℃等分储存,直至使用。为了评估S蛋白融入HIV病毒核心的情况,使用SW41转子(Beckman)在80000g下超速离心90分钟,通过20%蔗糖缓冲液(5ml)浓缩上清液(20ml)中的假病毒。将造粒后的假病毒溶解在50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,并通过电子显微镜检查。

伪病毒感染
使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)制备瞬时表达APN、ACE2或DPP4的HeLa细胞。将上述制备的假病毒加入到转染后24小时过度表达APN、ACE2或DPP4的HeLa细胞中。在感染后3小时,取出未吸收的病毒,用新鲜培养基替换。通过测量假病毒携带的报告基因赋予的荧光素酶活性来监测感染情况,使用荧光素酶检测系统(Promega),具体方法如下:感染后48小时裂解细胞,加入50μl荧光素酶底物后,取20μl裂解液测定荧光素酶活性。

审查人信息
《自然》感谢C.Drosten、G.Palacios和L.Saif对这项工作的同行评议的贡献。
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事实上,不仅是”武汉病毒学研究所”石正丽课题组对冠状病毒的研究活动,其他课题组对其他类型病毒的研究活动也是如此,他们追求的目标是通过基因操作使天然存在的病毒对人类具有更强的传染性、危险性和致命性。下一章将详细介绍这种功能增益研究和科学界各代表之间的相关激烈辩论。

4 “功能增益研究”:关于研究操纵病毒以提高传播性、危险性和死亡率的风险的国际辩论
2011年开始了关于研究操纵病毒以使其更具传染性、更危险并最终对人类更致命的潜在好处和危险的讨论。这场讨论主要是由国际研究小组的两篇科学论文引发的,这两篇论文显示了H5N1病毒(引起禽流感的病原体)如何通过基因改造使其对人类更具传染性[I.13、I.14]。这两篇由川冈义博和Ron Fouchier领导的研究小组发表在2012年《自然》和《科学》杂志上的论文,在此节选转载:
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《自然》486,420-428(2012年)

发布时间:2012年5月2日

H5 HA流感的实验适应性使雪貂的呼吸道飞沫传播到H5 HA/H1N1病毒的再交配体

Masaki Imai, Tokiko Watanabe, Masato Hatta, Subash C. Das, Makoto Ozawa, Kyoko Shinya, Gongxun Zhong, Anthony Hanson, Hiroaki Katsura, Shinji Watanabe, Chengjun Li, Eiryo Kawakami, Shinya Yamada, Maki Kiso, Yasuo Suzuki, Eileen A. Maher, Gabriele Neumann and Yoshihiro Kawaoka

摘要
高致病性禽类H5N1甲型流感病毒偶尔会感染人类,但目前并不能在人类之间有效传播。病毒血凝素(HA)蛋白是已知的宿主范围决定因素,因为它是介导病毒与宿主特异性细胞受体的结合。在这里,我们评估了HA的分子变化,这将使拥有H5亚型HA的病毒在哺乳动物之间传播。我们发现了一种H5 HA/H1N1重配病毒–包括H5 HA(来自H5N1病毒)与4个突变和来自2009年大流行的H1N1病毒的其余7个基因片段–能够在雪貂模型中飞沫传播。传播的H5重症病毒优先识别人型受体,在雪貂中高效复制,引起肺部病变和体重下降,但致病性不高,也没有引起死亡。这些结果表明,H5 HA可以转化为支持在哺乳动物中高效传播病毒的HA;然而,我们不知道这里发现的H5 HA中的4个突变是否会使完全是禽类的H5N1病毒具有传播性。其余7个病毒基因段的遗传来源也可能是哺乳动物传染的关键因素。然而,随着H5N1病毒的不断进化和感染人类,可能会出现具有大流行潜力的H5N1病毒的受体结合变体,包括这里测试的禽类-人类再同源病毒。我们的研究结果强调,需要为拥有H5 HA的流感病毒引起的潜在大流行做好准备,并将帮助在H5N1病毒流通地区进行监测的个人识别预测分离株大流行潜力的关键残基,从而为开发、生产和分发有效的应对措施提供信息。
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《科学》336,Issue 6088,pp.1534-1541,2012年6月22日:DOI:10.1126 / science.1213362

科学报告

甲型H5N1流感病毒在雪貂间的空气传播

Sander Herfst, Eefje J. A. Schrauwen, Martin Linster, Salin Chutinimitkul, Emmie de Wit , Vincent J. Munster , Erin M. Sorrell, Theo M. Bestebroer, David F. Burke, Derek J. Smith , Guus F. Rimmelzwaan, Albert D. M. E. Osterhaus, Ron A. M. Fouchier

摘要
高致病性禽流感A/H5N1病毒可导致人类发病和死亡,但迄今尚未获得在人类之间通过气溶胶或呼吸道飞沫传播(”空气传播”)的能力。为了解决该病毒在自然条件下可能获得这种能力的担忧,我们通过位点定向诱变和随后在雪貂中的连续通过,对A/H5N1病毒进行了基因改造。转基因的A/H5N1病毒在雪貂体内通过过程中获得了突变,最终成为雪貂体内的空气传播。在空气中感染突变的A/H5N1病毒后,没有一只受体雪貂死亡。在经空气传播的病毒中,宿主受体结合蛋白血凝素中的4个氨基酸替换和聚合酶复合蛋白碱性聚合酶2中的1个氨基酸替换始终存在。传播病毒对抗病毒药物奥司他韦敏感,与H5流感疫苗株培养的抗血清反应良好。因此,禽类A/H5N1流感病毒无需在中间宿主体内重组即可获得在哺乳动物之间传播的能力,因此构成人类大流行性流感的风险。
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即使在这两份出版物正式出现之前,科学家和政治家们就对这种研究成果是否应该完全公开,今后是否应该完全禁止”功能增益”的研究活动进行了非常密集的讨论和极富争议的争论。当时,人们已经担心与基因工程实验室意外释放人工制造的病毒可能引起的大流行的噩梦,对人类的潜在危险不可估量。
下面举一些科学期刊[III.6-III.9]的例子,可以很好地了解当时的讨论情况:
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《自然》480,421-422(2011年12月22日)doi:10.1038/480421a

自然|新闻

对实验室培育的流感的担忧越来越大

科学家呼吁对危险的禽流感变种采取更严格的生物安全措施。

Declan Butler

这是一个噩梦般的场景:由于致命的禽流感病毒H5N1的人为形式被意外释放,导致大流行。
然而,这种风险是非常真实的。自9月以来,一直流传着两组科学家的消息,据说他们创造了变异的H5N1变种,可以在雪貂之间传播,仅仅是呼吸相同的空气,一般情况下,这种病毒也很容易在人类之间传播。
这项工作提出了一种疾病的幽灵,传播速度与普通季节性流感一样快,但死亡率类似于野生型H5N1-一个数量级比大约2.5%的死亡率看到1918年灾难性流感大流行期间。
到目前为止,关于新变种的争论主要集中在研究是否会带来太大的安全风险而无法公布–即使是部分删节–美国国家生物安全科学顾问委员会(NSABB)目前正在考虑这个问题。
然而,一些科学家认为,国家生物安保科学顾问委员会的审议为时已晚。他们说,由于对新变种的进一步研究现在似乎不可避免,一个更重要的问题是,持有病毒样本的实验室—-以及今后将寻求与它们合作的人—-是否有足够的生物安全保护,以确保病毒无法逃脱。
“这匹马已经出了谷仓,”新泽西州皮斯卡塔韦市罗格斯大学的分子生物学家和生物防御专家理查德-埃布莱特说。他补充说:”在这一点上,讨论限制公布这些信息完全是徒劳的。”他指出,这些结果已经被包括裁判在内的许多流感科学家看到了,并且可能比加速的中微子更快地在流感葡萄藤中传播。
有消息称,其中一项由荷兰鹿特丹伊拉斯谟医学中心的Ron Fouchier领导的研究已提交给《科学》杂志,另一项由威斯康星大学麦迪逊分校的Yoshihiro Kawaoka领导的研究已送交《自然》杂志。(《自然》杂志的记者无法获得提交的稿件,也无法获得该杂志对稿件的机密审议)。Fouchier还于9月在马耳他举行的欧洲流感科学工作组年度会议上展示了他的成果。
突变菌株的产生并非出于不顾一切地想突破高风险科学的界限,而是为了更好地了解禽类H5N1变异成一种可以通过咳嗽或打喷嚏在人类中轻易传播的形式的可能性。一些病毒学家提出,任何使其更易传播的基因变化可能会钝化其致命性。新的工作似乎与这种令人欣慰的想法相矛盾。这些研究还应该有助于加强对野生型菌株的类似变化的监测,并开发诊断、药物和疫苗。
两次实验都是在被评为”生物安全3级(BSL-3)增强型”的实验室中进行的(见”安全程度”)。这类实验室要求科学家在离开实验室时必须淋浴和换衣服,并包括其他安全功能,如负气压和将废气通过高效微粒空气过滤器。一些病毒学家说,这应该足以防止病毒的意外释放。
纽约西奈山医学院的病毒学家Peter Palese说:”目前的生物安全规则足以安全地用H5N1病毒或任何其他流感病毒做这种传播实验”。
东京国立传染病研究所的病毒学家Masato Tashiro说,要求BSL-4设施的更严格的协议将阻碍开发针对H5N1大流行的对策所需的研究,因为它将限制能够与病毒一起工作的研究人员的数量。因此,他认为,这项工作应该在BSL-3强化设施中进行。

高安全性
但另一些人说,为了不仅保护研究病毒的研究人员,而且保护整个社会,必须将新的H5N1变种限制在BSL-4实验室。这些实验室的安全和安保措施要严格得多,例如要求工作人员穿上正压空气服,并进行更严格的洗消;有些实验室还采取了额外的安保措施,例如视频监控和防弹措施。Ebright说,把这些研究关在BSL-4设施中,也会立即限制病毒在实验室中的扩散,因为全世界只有几十个这样的设施。事实上,一位要求匿名的监管官员说,他最担心的是在生物安全文化或能力薄弱的国家的BSL-3实验室处理H5N1突变体。
位于吉隆的澳大利亚动物健康实验室高封闭设施的H5N1研究人员Deborah Middleton说,新变种的特征”符合BSL-4病原体的标准”,并补充说,她相信在她所在的机构中可能会这样处理。事实上,最初创造病毒的实验也应该在BSL-4设施中进行,法国里昂的Jean Meriéux-INSERM BSL-4实验室主任Hervé Raoul认为。
过去的经验表明,新的变种H5N1从实验室逃逸的风险远非微不足道。在过去十年中,严重急性呼吸道综合征(SARS)意外感染了中国大陆、台湾和新加坡四个高密闭度实验室的工作人员,这些实验室被评为BSL-3和BSL-4。美国国家研究委员会9月发布的一份报告详细介绍了2003年至2009年在美国使用特定制剂工作期间发生的395起生物安全违规事件–包括7起实验室获得的感染事件–这些事件有可能导致危险病原体从高密闭度实验室意外释放。
而逃逸的流感病毒的快速传播将使其比其他致命病原体更加危险。”当SARS或BSL-4病原体逃逸时,它们在全球范围内传播的可能性相当有限。”明尼阿波利斯的明尼苏达大学传染病研究和政策中心负责人、国家生物安保科学顾问委员会成员迈克尔-奥斯特霍姆说:”流感带来了一个非常困难的挑战,因为如果它曾经逃过一劫,它是一个很快就会在全世界范围内传播的。”
Fouchier拒绝对这些生物安全问题发表评论,只说他的实验已经过荷兰和美国当局的审查,在那里”H5N1病毒是3级病原体,因为有抗病毒药物和疫苗”。Kawaoka没有回应采访要求。
一些科学家说,他们期待世界卫生组织(WHO)在这场生物安全辩论中及时提供领导。但世卫组织在瑞士日内瓦的发言人Gregory Hartl表示,该机构无法发表评论,因为它还没有看到书面研究报告。同时,国家生物安全科学顾问委员会也没有表示何时会公布其建议。美国农业部在给《自然》杂志的一份声明中说,它(和美国卫生和人类服务部)将对新的H5N1变种进行任何适当的技术审查。
Ebright感叹,生物安全和生物安保的重要问题主要由研究人员个人来决定。”在美国,生物安全只有自愿监督,除了选择制剂规则外,没有对生物安全的监督,”他说。米德尔顿说,如果有选择的话,流感研究人员往往会拒绝在更高的生物安全级别中工作,原因很简单,他们不会再方便地在自己研究所的BSL-3实验室中进行研究,而且在BSL-4实验室中工作本身就比较困难。
Ebright指出,这种情况与监管将人类受试者置于危险之中的研究的大量立法形成了鲜明的对比,在这些立法中,拟议的项目在开始之前都要经过严格的审查。”Ebright说,”值得注意的是,对H5N1这种类型的双重用途研究,”不仅危及一个人,而且可能危及几百、几千或几百万人,但却没有任何监督”。
12月20日,美国国家生物安全科学咨询委员会(NSABB)发表声明,概述了其对正在审查的两项流感研究的作者以及考虑发表这些研究的期刊编辑的建议。声明中说:
“鉴于研究结果对公共卫生和研究界的重要性,国家生物安保科学顾问委员会建议发表强调新成果的一般性结论,但稿件中不包括可能使那些试图造成伤害的人复制实验的方法和其他细节。国家生物安保科学顾问委员会还建议在手稿中增加文字,更好地解释研究的目标和潜在的公共健康益处,并详细说明为保护实验室工作人员和公众而采取的广泛的安全和安保措施”。
对此,《科学》主编布鲁斯-阿尔伯茨表示:
“《科学》编辑将评估如何以最佳方式进行。我们的反应将在很大程度上取决于美国政府采取进一步的措施,制定一项书面的、透明的计划,以确保将出版物中遗漏的任何信息提供给所有要求提供信息的负责任的科学家,作为他们改善公众健康和安全的合法努力的一部分”。
对此,《自然》主编菲利普-坎贝尔表示:
“我们注意到国家生物安保科学顾问委员会提出的前所未有的建议,这些建议限制公众获取数据及其方法,并认识到这些建议背后的动机。研究人员必须获得对流感病毒进行科学分析的全部细节,这对公众健康至关重要。我们正在与有关各方讨论如何在国家生物安保科学顾问委员会建议的情况下,使人们能够适当地使用科学方法并获取数据。
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7 参考文献
I)基于科学同行评审的科学文献(“同行评审”):

[I.1] Fan Wu, Su Zhao, Bin Yu, Yan-Mei Chen, Wen Wang, Zhi-Gang Song, Yi Hu, Zhao-Wu Tao, Jun-Hua Tian, Yuan-Yuan Pei, Ming-Li Yuan, Yu-Ling Zhang, Fa-Hui Dai, Yi Liu, Qi-Min Wang, Jiao-Jiao Zheng, Lin Xu, Edward C. Holmes and Yong-Zhen Zhang,《自然》579,265–269(2020):“与中国的人类呼吸系统疾病有关的新型冠状病毒”。

[I.2] Chaolin Huang, Yeming Wang, Xingwang Li, Lili Ren, Jianping Zhao, Yi Hu, Li Zhang, Guohui Fan, Jiuyang Xu, Xiaoying Gu, Zhenshun Cheng, Ting Yu, Jiaan Xia, Yuan Wei, Wenjuan Wu, Xuelei Xie, Wen Yin, Hui Li, Min Liu, Yan Xiao, Hong Gao, Li Guo, Jungang Xie, Guangfa Wang, Rongmeng Jiang, Zhancheng Gao, Qi Jin, Jianwei Wang and Bin Cao, Lancet 395,497–506(2020):“中国武汉市2019年新型冠状病毒感染患者的临床特征”。

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[I.4] Peng Zhou, Xing-Lou Yang, Xian-Guang Wang, Ben Hu, Lei Zhang, Wei Zhang, Hao-Rui Si, Yan Zhu, Bei Li, Chao-Lin Huang, Hui-Dong Chen, Jing Chen, Yun Luo, Hua Guo, Ren-Di Jiang, Mei-Qin Liu, Ying Chen, Xu-Rui Shen, Xi Wang, Xiao-Shuang Zheng, Kai Zhao, Quan-Jiao Chen, Fei Deng, Lin-Lin Liu, Bing Yan, Fa-Xian Zhan, Yan-Yi Wang, Geng-Fu Xiao and Zheng-Li Shi, 《自然》 579,270-273(2020):“可能是来源于蝙蝠的新冠状病毒相关的肺炎暴发”。

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[I.7] Xing-Yi Ge, Jia-Lu Li, Xing-Lou Yang, Aleksei A. Chmura, Guangjian Zhu, Jonathan H. Epstein, Jonna K. Mazet, Ben Hu, Wei Zhang, Cheng Peng, Yu-Ji Zhang, Chu-Ming Luo, Bing Tan, Ning Wang, Yan Zhu, Gary Crameri, Shu-Yi Zhang, Lin-Fa Wang, Peter Daszak and Zheng-Li Shi, 《自然》503,535-538(2013):“使用ACE2受体的蝙蝠类SARS冠状病毒的分离和鉴定”。

[I.8] Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi and Ralph S Baric, 《自然医学》21,1508-1513(2015):“ SARS样的循环蝙蝠冠状病毒簇显示出对人类的潜力”。

[I.9] Ben Hu , Lei-Ping Zeng , Xing-Lou Yang , Xing-Yi Ge, Wei Zhang,Bei Li, Jia-Zheng Xie, Xu-Rui Shen, Yun-Zhi Zhang, Ning Wang, Dong-Sheng Luo, Xiao-Shuang Zheng, Mei-Niang Wang, Peter Daszak, Lin-Fa Wang, Jie Cui and Zheng-Li Shi, PLoS Pathogens 13(11),e1006698(2017):”发现蝙蝠SARS相关冠状病毒的丰富基因库,为SARS冠状病毒的起源提供了新的见解”。

[I.10] Peng Zhou, Hang Fan, Tian Lan, Xing-Lou Yang, Wei-Feng Shi, Wei Zhang, Yan Zhu, Ya-Wei Zhang, Qing-Mei Xie, Shailendra Mani, Xiao-Shuang Zheng, Bei Li, Jin-Man Li, Hua Guo, Guang-Qian Pei, Xiao-Ping An, Jun-Wei Chen, Ling Zhou, Kai-Jie Mai, Zi-Xian Wu, Di Li, Danielle E. Anderson, Li-Biao Zhang, Shi-Yue Li, Zhi-Qiang Mi, Tong-Tong He, Feng Cong, Peng-Ju Guo, Ren Huang, Yun Luo, Xiang-Ling Liu, Jing Chen, Yong Huang, Qiang Sun, Xiang-Li-Lan Zhang, Yuan-Yuan Wang, Shao-Zhen Xing, Yan-Shan Chen, Yuan Sun, Juan Li, Peter Daszak, Lin-Fa Wang, Zheng-Li Shi, Yi-Gang Tong and Jing-Yun Ma, 《自然》556,255-258(2018年)。”致命的猪急性腹泻综合征由一种源自蝙蝠的HKU2相关冠状病毒引起”。

[I.11] D. Paraskevis, E. G. Kostaki, G. Magiorkinis, G. Panayiotakopoulos, G. Sourvinos, S. Tsiodras, Infect. Genet. Evol. 79, 104212 (2020). doi: 10.1016/j.meegid.2020.104212. Epub 2020 Jan 27: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.26.920249v1: “新型冠状病毒(2019-nCoV)的全基因组进化分析,否定了作为最近一次重组事件的结果出现的假说”。

[I.12] Manli Wang and Zhihong Hu, Virol. Sin. 28(6),315-317(2013):“蝙蝠作为SARS冠状病毒的动物宿主:经过10年的病毒狩猎,假说得到了证明”。

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[I.14] Sander Herfst, Eefje J. A. Schrauwen, Martin Linster, Salin Chutinimitkul, Emmie de Wit, Vincent J. Munster, Erin M. Sorrell, Theo M. Bestebroer, David F. Burke, Derek J. Smith, Guus F. Rimmelzwaan, Albert D. M. E. Osterhaus, Ron A. M. Fouchier, 《科学》336, 1534-1541(2012年):”A/H5N1流感病毒在雪貂之间进行空气传播”。

[I.15] Biao He, Yuzhen Zhang, Lin Xu, Weihong Yang, Fanli Yang, Yun Feng, Lele Xia, Jihua Zhou, Weibin Zhen, Ye Feng, Huancheng Guo, Hailin Zhang, Changchun Tua, 《病毒学杂志》88, 7070-7082 (2014):”鉴定来自中国蝙蝠的多种阿尔法冠状病毒并对一种新型严重急性呼吸道综合症样冠状病毒进行基因组学鉴定”。

[I.16] Dan Hu, Changqiang Zhu, Lele Ai, Ting He, Yi Wang, Fuqiang Ye, Lu Yang, Chenxi Ding, Xuhui Zhu, Ruicheng Lv, Jin Zhu, Bachar Hassan, Youjun Feng, Weilong Tan, Changjun Wang, 《新出现的微生物与感染》7,154(2018):“中国蝙蝠中一种新型SARS样冠状病毒的基因组特征和感染性”。

II)未经同行评审的科学文献(”预印本”):

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[II.2] M. Singla, S. Ahmad, C. Gupta, and T. Sethi:“RaTG13基因组的De-novo装配揭示了不一致之处,进一步掩盖了SARS-CoV-2的起源。”网页: https://doi.org/10.20944/preprints202008.0595.v1 (2020).

[II.3] Dean Bengston: “所有利用RaTG13 bat菌株基因组学评估SARS-CoV-2起源或流行病学的期刊文章均可能存在缺陷,应撤回。”网页: https://doi.org/10.31219/osf.io/wy89d (2020).

[II.4] Botao Xiao und Lei Xiao: “2019-nCoV冠状病毒的可能起源”。网页: https://web.archive.org/web/20200214144447/https:/www.researchgate.net/publication/339070128_The_possible_origins_of_2019-nCoV_coronavirus (2020 二月)

[II.5] Li-Meng Yan, Shu Kang, Jie Guan and Shanchang Hu: “SARS-CoV-2基因组的不寻常特征表明,该基因组是经过复杂的实验室改造而非自然进化,并确定了其可能的合成途径”。网页: https://zenodo.org/record/4028830#.X_BoYNhKh3j (2020年9月14)。

[II.6] Sakshi Piplani, Puneet Kumar Singh, David A. Winkler, Nikolai Petrovsky: “穗蛋白-ACE2在不同物种间结合的亲和力的硅科比较;对SARS-CoV-2病毒的可能来源的意义”。网页(2020年5月13日)。 arXiv:2005.06199v1

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[II.10] Christian Enemark: “生物安全和对全球健康的风险”, 《牛津全球卫生政治手册》, 编辑Colin McInnes, Kelley Lee, Jeremy Youde. 网上公布日期:2018年1月。DOI: 10.1093/oxfordhb/9780190456818.013.12

III)在科学文献中发表的信件、信函和评论:

[III.1] Kristian G. Andersen, Andrew Rambaut, W. Ian Lipkin, Edward C. Holmes and Robert F. Garry, 《自然医学》26, 450-452 (2020): “SARS-CoV-2的近端起源”。

[III.2] Declan Butler, 《自然》(2015), doi:10.1038/nature.2015.18787: “工程化蝙蝠病毒引发风险研究的讨论”。网页:https://www.nature.com/news/engineered-bat-virus-stirs-debate-over-riskyresearch-1.18787

[III.3] Andrew Green, Lancet 395, p. 682, 2020年2月29: “李文亮”。

[III.4] Charles Calisher, Dennis Carroll, Rita Colwell, Ronald B Corley, Peter Daszak, Christian Drosten, Luis Enjuanes, Jeremy Farrar, Hume Field, Josie Golding, Alexander Gorbalenya, Bart Haagmans, James M Hughes, William B Karesh, Gerald T Keusch, Sai Kit Lam, Juan Lubroth, John S Mackenzie, Larry Madoff, Jonna Mazet, Peter Palese, Stanley Perlman, Leo Poon, Bernard Roizman, Linda Saif, Kanta Subbarao, Mike Turner, Lancet 395, Issue 10226, PE42-E43 (2020): “支持中国抗击COVID-19的科学家、公共卫生专业人员和医务人员的声明”。网页:https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30418-9

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[III.12] Declan Butler, 《自然》503, 19 (2013): “查询病原体研究法”。

[III.13] Heidi Ledford, 《自然》(2013), „科学家呼吁欧洲就突变流感研究进行紧急会谈”。网页(2013年12月20日) https://doi.org/10.1038/nature.2013.14429.

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IV)在平面和网络媒体上发表的文章:

[IV.1] FOCUS网上社论:“病毒从何而来?Drosten为新冠起源带来新的说法”。网页(2020年5月8日) https://www.focus.de/gesundheit/news/woher-kommt-das-coronavirus-drosten-bringt-neuen-ansatz-zu-ursprung-ins-spiel_id_11924915.html

[IV.2] Eva Fu, 大纪元时报, 新加坡版:”独家:中国在官方时间表前几个月就有类似COVID的病人”。网页: https://epochtimes.today/exclusive-china-had-covid-like-patients-months-before-official-timeline/

[IV.3] FOCUS网上社论: „武汉病毒是怎么来的?研究人员驳斥阴谋论“。网页(2020年3月24) https://www.focus.de/gesundheit/news/verschwoerungstheorie-endgueltig-widerlegt-nicht-aus-dem-labor-forscher-beweisen-dass-sars-cov-2-natuerlich-entstanden-ist_id_11801624.html

[IV.4] Lawrence Sellin, GMWATCH: “说明:有科学迹象表明COVID-19是人为的”。网页(2020年5月15) https://www.gmwatch.org/en/news/latest-news/19406

[IV.5] Josh Rogin, THE WASHINGTON POST, 4月14日(2020): „国务院电报警告武汉实验室研究蝙蝠冠状病毒存在安全问题”。

[IV.6] TAGESSPIEGEL: „批评者消失,欧盟出现游行:中国就是这样厚颜无耻地掩盖了新冠的起源“。网页(2020年5月7日) https://www.tagesspiegel.de/politik/kritiker-verschwinden-die-eu-wird-vorgefuehrt-so-dreist-vertuscht-china-die-urspruenge-von-corona/25809708.html

[IV.7] ZEIT Online: „疫情起源:中国当局没有主动向世卫组织通报冠状病毒的情况“。网页(2020年7月4日) https://www.zeit.de/wissen/gesundheit/2020-07/who-chronologie-coronavirus-pandemie-covid-19-ausbruch

[IV.8] Lukas Rogalla, FRANKFURTER RUNDSCHAU: „不当行为曝光–“武汉档案”:来自中国的文件揭示了新冠大流行初期的混乱局面“。网页(2020年12月3日) https://www.fr.de/politik/corona-coronavirus-china-wuhan-leaks-virus-ursprung-kekule-virologe-italien-90119716.html

[IV.9] MERKUR: 冠状病毒英雄现在已经死了–他没有让这一切被掩盖。网页(2020年3月1日) https://www.merkur.de/welt/coronavirus-china-vertuschung-wuhan-li-wenliang-arzt-zr-13529620.html

[IV.10] Keoni Everington, 台湾新闻:”腾讯可能不小心泄露了武汉病毒死亡的真实数据。网页(2020年2月5日) https://www.taiwannews.com.tw/en/news/3871594

[IV.11] Christina Zhao, NEWSWEEK: “武汉COVID-19死亡人数或达上万”。网页(2020年3月29) https://www.newsweek.com/wuhan-covid-19-death-toll-may-tens-thousands-data-cremations-shipments-urns-suggest-1494914

[IV.12] GREATGAMEINDIA: “COVID19档案–关于冠状病毒神秘起源的科学调查”。网页(2020年2月21日) https://greatgameindia.com/covid19-files-scientific-investigation-on-mysterious-origin-of-coronavirus/

[IV.13] https://www.youtube.com/watch?v=bpQFCcSI0pU

[IV.14] Matthew Strong, 台湾新闻:”中方要求世卫组织掩盖冠状病毒疫情:德国情报部门”。网页(2020年5月9日) https://www.taiwannews.com.tw/en/news/3931126

[IV.15] Wikipedia: Fang Bin. 网页(2020年1月28) https://en.wikipedia.org/wiki/Fang_Bin

[IV.16] Sharri Markson, DAILY TELEGRAPH: “新南威尔士州的冠状病毒:档案中列出了针对中国蝙蝠病毒项目的案例”。网页(2020年5月4日) https://www.dailytelegraph.com.au/coronavirus/bombshell-dossier-lays-out-case-against-chinese-bat-virus-program/news-story/55add857058731c9c71c0e96ad17da60

[IV.17] Christina Lin: “美国为何将蝙蝠病毒研究外包给武汉?”。网页(2020年4月) https://www.ispsw.com/wp-content/uploads/2020/04/689_Lin.pdf

[IV.18] Sam Husseini, 独立科学新闻: “Peter Daszak的生态健康联盟隐藏了近4000万美元的五角大楼资金和军事化的大流行病科学”。网页(2020年12月16日) https://www.independentsciencenews.org/news/peter-daszaks-ecohealth-alliance-has-hidden-almost-40-million-in-pentagon-funding/

[IV.19] Denise Grady, 纽约时报, 8月5日(2019): „致命病菌研究因安全隐患被关闭的陆军实验室”.

[IV.20] https://www.youtube.com/watch?v=qbUgF_mQy90&feature=youtu.be

[IV.21] Steve Watson, SUMMIT NEWS: “2018年的视频显示,中国科学家在武汉实验室研究冠状病毒”。网页(2020年4月30日) https://summit.news/2020/04/30/video-from-2018-shows-chinese-scientists-working-on-coronavirus-in-wuhan-lab

[IV.22] https://www.documentcloud.org/documents/6884792-MACE-E-PAI-COVID-19-ANALYSIS-Redacted.html

[IV.23] GREATGAMEINDIA: “转录:生物武器专家弗朗西斯-博伊尔博士谈冠状病毒”。网页(2020年2月5日) https://greatgameindia.com/transcript-bioweapons-expert-dr-francis-boyle-on-coronavirus/

[IV.24] 数学和科学学会关于COVID-19大流行病的立场的文件,2020年5月6日。网页: http://www.wissenschaft-verbindet.de/pdf/Stellungnahme_der_Fachgesellschaften_zu_Corona.pdf

[IV.25] 科学对话,科学晴雨表新冠特别版。网页:https://www.wissenschaft-im-dialog.de/projekte/wissenschaftsbarometer/wissenschaftsbarometer-corona-spezial/

[IV.26] Sara Dorn, 纽约邮报: “‘越来越多的证据’显示COVID-19从中国实验室泄露:美国官员”。网页(2021年1月2日) https://nypost.com/2021/01/02/growing-body-of-evidence-shows-covid-19-leaked-from-chinese-lab-us-official/?utm_medium=SocialFlow&utm_campaign=SocialFlow&utm_source=NYPTwitter

[IV.27] Javier C. Hernández, 纽约时报: “知名西方出版商向中国审查制度屈服”。网页(2017年11月1日) https://www.nytimes.com/2017/11/01/world/asia/china-springer-nature-censorship.html

[IV.28] Jane Qiu, 科学美国人: “中国的”蝙蝠女”如何追捕从SARS到新型冠状病毒的病毒?”。网页(2020年6月1日) https://www.scientificamerican.com/article/how-chinas-bat-woman-hunted-down-viruses-from-sars-to-the-new-coronavirus1/
注:本文最初发表于《科学美国人》,标题为”追逐瘟疫”。322, 6, 24-32 (2020年6月)。

[IV.29] 40. NDR信息播客: „Christian Drosten谈新冠更新“ 2020年5月12日。网页:https://www.ndr.de/nachrichten/info/podcast4684.html

[IV.30] Mathias Bröckers: „pLai3ΔenvLuc2 – 随着HIV伪病毒冠状病毒成为人类的危险?“ 网页(2020年4月20日) https://www.heise.de/tp/features/pLai3-envLuc2-Wurde-mit-HIV-Pseudovirus-das-Coronavirus-fuer-den-Menschen-gefaehrlich-4705632.html

[IV.31] 致世卫组织COVID-19国际调查组的公开信。网页:https://www.ipetitions.com/petition/open-letter-to-the-who-covid-19-international

德国汉堡大学罗兰-维森丹格教授:冠状病毒大流行的起源研究(中文译文)第一部分
德国汉堡大学罗兰-维森丹格教授:冠状病毒大流行的起源研究(中文译文)第三部分

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