軍人出身的千人計畫引進人才薑世勃是否已掌握中共病毒的解藥

撰稿:喜馬拉雅的肉夾饃;審核:喜馬拉雅的饃夾肉;校對:Maarago

未來論壇2020年04月23日發佈了未來論壇 | 薑世勃:廣譜抗冠疫苗和藥物是戰勝疫情的終極武器

薑世勃在演講中透露出的重要內容有:

1、[武漢病毒所肖庚富研究員的團隊,在20天內發現可用於治療新冠肺炎的藥物比如瑞德西韋、氯喹,他們文章發表在Cell Research,在短短的兩個月之內已經被98萬人次點擊,引用107次,現在這兩個藥已經在臨床使用或在臨床觀察當中。]這一條是對氯喹的治療效果的確認;

2、軍科院陳薇團隊的火速研發疫苗和臨床試驗——[在3月19日,軍科院陳薇院士領先研發的新冠疫苗獲批臨床試驗,現在108名志願者已經完成了一期臨床試驗,同時第二期臨床試驗已經於4月9日開始,該科研團隊在三個月內完成了抗新冠疫苗的設計、實驗室製備、動物免疫及抗血清檢測、在新冠肺炎動物模型中的有效性評估、疫苗的cGMP製備、動物的GLP安全性評估、I期臨床試驗,這絕對也是一項世界紀錄。]

3、在2020年4月份薑世勃演講的當時中共國家衛健委已經在進行十幾項疫苗的專案——[國家衛健委衛生科技發展中心的鄭主任介紹,我們目前有5條研發技術路線,包括滅活疫苗、基因工程重組亞單位疫苗、病原體載體疫苗、減毒流感病毒載體疫苗、核酸疫苗等等,大概有十幾項疫苗項目正在進行中。]

4、薑世勃團隊在研製疫苗採取的“並聯”研發過程是——[我們按正常程式一個疫苗研究從最初抗原製備到動物免疫、中和活性鑒定、動物攻毒保護實驗、動物安全性評價到臨床試驗,一直到規模化生產,這整個過程可能需要四至五年甚至十幾年才能完成。但是現在我們希望能在一年之內完成這些工作,所以不能按照常規的方法進行。常規方法是循序漸進,一步完成以後再進行第二步、第三步,現在是多個團隊在同時進行,有人在檢測中和活性,另外有人做動物攻毒實驗、動物安全性評價以及臨床研究,多個團隊同時進行就是將串聯改成並聯。]

5、薑世勃關於冠狀病毒廣譜性的分類——[我說的廣譜是指:小廣譜、中廣譜、大廣譜。小廣譜是針對B亞型的β冠狀病毒,包括SARS冠狀病毒、新型冠狀病毒以及來自蝙蝠的SARS相關病毒,這三個病毒可引起現在和未來的新型冠狀病毒疫情,而且它們都使用ACE2作為受體。所以這種小廣譜抗冠狀病毒疫苗不是很難研發出來。第二種是中廣譜,包括所有B型冠狀病毒,包括SARS冠狀病毒、新冠病毒和SARS相關病毒以及MERS冠狀病毒,這個可能比較困難一點,因為MERS冠狀病毒使用不同受體。第三種是大廣譜,包括所有的人類冠狀病毒,這是非常困難的。剛才說到不同型的冠狀病毒可能使用不同的受體,因此,它們的受體結合域氨基酸序列可能是大不相同的。]

6、關於新冠疫苗的分類——[剛才談到新冠疫苗有很多類型,比如滅活疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗,根據疫苗抗原主要分為三類:一是病毒顆粒,包括滅活和減毒疫苗;二是S蛋白疫苗,包括全長S蛋白;三是受體結合域(RBD)疫苗。全長S蛋白在酶解之後分為兩個亞單位,S1亞單位含有NTD、RBD兩個重要功能區域。這是S蛋白的空間結構。S2亞單位有三個功能區,包括融合肽(FP)、HR1和HR2,它們介導病毒和細胞的結合。RBD中間還有一個受體結合基序,稱之為RBM,RBM的氨基酸序列在各個冠狀病毒的S蛋白中變化比較大。]

7、薑世勃團隊的研發步驟——[第一步,對RBD進行優化,增強它的中和免疫原性和廣譜性。我們將使用“中和免疫原性指數(NII)”和“廣譜中和免疫原性指數(BNII)”來評估RBD的中和免疫原性。採用“摘帽”和“帶帽”的策略優化。因為RBD中有些和受體結合的關鍵部位可能被糖基化帽子掩蓋了,我們就把它的糖基化帽子去掉。而有些部位誘導的非中和抗體過強,我們就用糖基化帽子遮蓋住。通過測試我們發現,這樣做中和抗體效價明顯上升。這個方法我們還在優化,不單提高RBD的中和免疫原性,也提高它的廣譜性。RBD中有些保守區域也可以誘導一些廣譜中和抗體,但是由於被非中和抗體顯性表位的免疫優勢所壓制,它的中和抗體免疫原性無法顯現出來。如果將這些非中和抗體顯性表位帶帽遮住後,那些比較保守的中和抗體位點就佔據了優勢,就可能產生更多的廣譜中和抗體。第二步是將優化後的RBD與含有T細胞抗原表位的蛋白片段連接形成疫苗抗原。雖然RBD也含有一些T細胞抗原表位,但更多的是在N蛋白或S蛋白的S2區,我們通過不同的方法把這些T細胞抗原表位找出來以後和將它們與RBD連接,形成一個既可以產生高效價中和抗體,也可以有T細胞免疫反應的抗原。最後我們將使用適當的免疫佐劑提高其免疫原性。]

8、薑世勃團隊關於研發安全、高效、廣譜的抗冠狀病毒藥物的思路——

[冠狀病毒和受體結合以後,通過表面膜融合或內吞膜融合進入細胞內,在冠狀病毒酶的作用之下產生新的病毒顆粒,並釋放出來。所以這裡有兩個酶可能成為重要的廣譜抗冠狀病毒藥物的作用靶點。它們分別是Mpro(M蛋白酶)、RdRp(RNA 依賴RNA 聚合酶)。例如瑞德西韋和NHC都能作用在RdRp酶。最近饒子和院士團隊先後在Science、Nature發表了這兩個蛋白質的空間結構,為設計廣譜抗冠狀病毒藥物提供了藥物靶點的結構學基礎。我們研究的多肽主要作用在病毒的融合和進入階段,從而使得病毒沒辦法進入細胞。

病毒融合是怎樣一個過程呢?冠狀病毒表面S蛋白的受體結合域(RBD)和細胞上的受體ACE2結合,如果細胞表面有跨膜絲氨酸蛋白酶,它就可以把S蛋白切割成S1和S2兩個亞單位,S2亞單位可以介導膜融合,病毒的基因物質可以進入細胞內進行複製。如果細胞表面沒有這個酶,病毒可以通過內吞的形式進入細胞內。在內吞泡中的酸性環境以及組織蛋白酶的作用下,病毒膜也可以和內吞膜泡融合,把病毒的基因物質釋放到細胞內,這是表面膜融合和內吞膜融合。我們想要設計出的融合/進入抑制劑可以作用這兩個階段,進而阻止病毒進入細胞。

我先介紹一下我30年前做的工作,那時候主要是研究抗HIV的多肽進入抑制劑。愛滋病病毒表面有gp120、gp41,CD4+ T細胞表面有兩個受體,一個是CD4,一個是共受體。當gp120和CD4結合之後,再和共受體結合,gp41暴露,其融合多肽(FP)插入靶細胞膜內,然後介導病毒膜和細胞膜的融合,因此HIV的gp41在病毒的融合過程有重要的功能。

gp41的分子結構有三個重要的功能區:N端融合多肽、NHR和CHR。它們的功能是介導病毒的膜融合。衍生於NHR和CHR的多肽稱之為N多肽和C多肽。在90年代早期,我們發現了第一個高效抗HIV的C多肽SJ-2176,它能夠抑制HIV進入細胞內,比當時最好的抗愛滋病藥-AZT的效果還好。我在1992年申請了美國專利,1993年文章發表在Nature。1994年,杜克大學一些研究人員把我們多肽向右邊移動8個氨基酸,產生了新多肽T20,他們文章發表在PNAS。1995年,MIT的研究人員把整個gp41用酶進行消化,發現了一個酶消化不了的複合物,從中分出來N36和C34兩個多肽。而C34多肽正好比我們的SJ-2176的N和C段分別多兩個氨基酸,這就是當時三家單位先後發現了三個HIV融合抑制多肽的故事。

1995年杜克大學的研究人員成立了Trimeris公司,專門研發T20,但是因為他們的多肽和我們的多肽有70%以上的序列是完全一樣的,所以他們必須買斷我們的專利。後來1998年羅氏出資8.4億美元,把這個多肽推向臨床,2003年恩夫韋肽被美國FDA批准,成為第一個多肽類的HIV融合抑制劑。

它的作用機制是什麼?這是一個病毒顆粒,表面有兩個蛋白gp120和gp41,gp120和CD4及共受體結合之後,gp41就像一個彈簧刀一樣彈開,它的融合多肽紮入靶細胞膜內,它的HR1和HR2相互作用,形成一個髮夾樣結構,三個髮夾樣結構形成一個六聚體,把病毒膜和細胞膜拉在一起發生融合,病毒的基因物質進入靶細胞內進行複製。T20衍生於病毒gp41的HR2區域,它也可以與病毒gp41的HR1區作用形成異源六聚體,這樣導致病毒的HR2不能和它作用,這樣就阻止了病毒和細胞的融合,我們稱之為“以其人之道,還治其人之身”。]

9、HIV多肽的廣譜效果——[抗HIV多肽的發現開闢了多肽類病毒融合/進入抑制劑的全新領域。除了HIV以外,還有呼吸道合胞病毒、尼帕病毒、埃博拉病毒、流感病毒和冠狀病毒,都屬於I型包膜病毒。許多這些病毒都可以引起高致病傳染病,比如埃博拉、SARS、MERS、新冠肺炎等。所以我們可以使用同樣的策略來研究抗這些病毒的融合多肽。在2004年我們發現第一個高效抗SARS冠狀病毒的多肽。SARS起源於蝙蝠,中間宿主是果子狸,病毒傳到人以後,感染人含有ACE2的呼吸道上皮細胞。我們當時很快的分析了S2區域的序列,找到HR1和HR2的片斷,然後設計了4條HR1P多肽和2條HR2P多肽。我們發現HR2P多肽能夠和HR1P多肽結合形成六聚體,具有很好的抗SARS病毒的作用。它的機制和HIV非常相似。SARS冠狀病毒表面也有兩個蛋白S1和S2,S1和受體結合以後,S2的融合多肽紮入靶細胞膜內,HR2區和HR1區相互作用形成六聚體,把病毒膜和細胞膜融合在一起。如果我們在HR2區設計多肽,它也可以和HR1結合形成六聚體,這樣就阻止了病毒HR2和HR1相互作用,也就不能形成六聚體進入病毒細胞。

我們也發現了抗MERS冠狀病毒多肽。2012年中東地區出現了MERS冠狀病毒,已經傳到全世界27個國家,近2500個確診病例,病死率達到34%。這個病毒最初來源於蝙蝠,中間宿主是單峰駱駝。這個病毒是有限人傳人,大部分還是從動物到人。]

10、關於廣譜冠狀病毒多肽——EK1

10.1[我們把五個現有的冠狀病毒設計了5條HR1多肽和5條HR2多肽,檢測這10條多肽對5個不同病毒的細胞融合作用。結果發現,衍生於不同冠狀病毒HR2P多肽都能有效地抑制同源冠狀病毒的感染,而衍生於OC43的HR2P多肽可以抑制所有的5種冠狀病毒的感染。表明了OC43的HR2P多肽可能是一個廣譜多肽。我們把OC43多肽進行了修飾,引入了帶有正電荷和負電荷的氨基酸,形成一個內部鹽橋,使其更穩定更有效,這就是EK1多肽。我們發現EK1比OC43多肽具有更高的抑制活性,而且對我們檢測的幾種冠狀病毒,包括人的冠狀病毒和3種來自蝙蝠的冠狀病毒都有效,對細胞融合、假病毒和活病毒感染都有很好的抑制效果。]

10.2薑世勃團隊的多肽與冠狀病毒S蛋白序列完全一樣——[新冠病毒出現以後,我們立即檢測了EK1多肽的抗病毒作用。大家知道從1月首先在武漢地區報導的新冠病毒感染,至今不到4個多月,全世界超過200萬人感染,造成13萬人的死亡。這個傳播速度是以前沒有過的。

我們很快把新冠病毒S蛋白序列分析出來了,找到它的HR1和HR2區,設計了衍生於新冠病毒HR2區的多肽,實際上,這個多肽和SARS冠狀病毒S蛋白的HR2區的氨基酸序列是完全一樣的。]

10.3[我們建立了細胞融合實驗,發現EK1能夠有效地抑制S蛋白介導的細胞融合,也能抑制假病毒的感染。同樣我們也解析了它的六聚體結構,發現新冠病毒和其它冠狀病毒的結構非常相似,也是由長的HR1和短的HR2形成一個核心的融膜結構。我們對EK1多肽進行了優化,在其C端用不同長度的PEG連接膽固醇,後來發現其中一個叫做EK1C4的活性比EK1和新冠病毒HR2P多肽細胞融合抑制活性高出240倍,它抑制假病毒活性是EK1和HR2P的150倍,可以說是最有潛力的廣譜抗冠狀病毒藥物的候選,它的半數有效抑制濃度(IC50)可以到1.3nmol,這是非常有效的。]

10.4EK1C4的廣譜性——[我們發現EK1C4能夠抑制6種人的冠狀病毒的膜融合,3種蝙蝠的冠狀病毒的膜融合,而且活性比EK1多肽高出100到200倍。它還能抑制人的冠狀病毒(假病毒)和2種蝙蝠SARS相關病毒(假病毒)感染活性。除此之外,我們還研究了其對5種活的人冠狀病毒的作用,包括MERS冠狀病毒、新冠病毒、OC43、229E以及NL63,發現它同樣有非常好的抑制作用。]

10.54EK1C4的遠景——[這些工作證明,EK1C4脂多肽是高效廣譜的抗冠狀病毒多肽,將來有望能以鼻腔噴霧或者吸入劑的形式預防和治療新冠病毒、SARS-CoV、MERS-CoV感染,也可以預防和治療將來新發與再現的SARS相關病毒(SARSr-CoV)的感染,這是非常廣譜的。]

11、多肽類疫苗的經濟性——[廣譜抗冠多肽是防控現在和未來新冠疫情的最佳武器之一。刺突蛋白HR1區是研發廣譜抗冠多肽藥物的最佳靶點之一。因為它是S蛋白中最為保守的區域,特別適合於研發多肽藥物。這個區域只能讓40kD以下的多肽或小分子蛋白進去,而抗體的分子量在150kD進不去,因此並不適合開發抗體。但小分子又太小,沒有力量阻止病毒HR1和HR2區的相互作用,所以最適合研發多肽。]

12、多肽類疫苗的易生產和便捷性——[這個多肽容易規模化生產,生產成本遠低於抗體。我們現在國內有很多大的多肽公司,把序列交給公司以後,大概一個月或兩個月可以生產一公斤的cGMP多肽用於臨床使用。其成本是遠遠低於生產抗體的成本。多肽粉可以在常溫下儲存和運輸,而抗體必須要低溫儲存和運輸。多肽可用於預防和治療冠狀病毒感染,可以用鼻腔噴霧和霧化吸入,這個使用方法既方便又安全。比如我們要參加一個聚會,吃飯的時候不能戴口罩,可以帶上這個小噴霧瓶,提前自己噴上,避免被別人感染。如果你得了新冠肺炎感染以後,可以買一個小的霧化吸入器放在家裡面,多肽進入肺泡以後抑制病毒複製和感染,病毒載量大大降低,造成的肺損傷概率也明顯降低。同時因為降低肺部病毒載量,也減少了感染家人或其他人的機會,可以說一舉兩得。]

綜述:薑世勃最初是一名軍醫,隨後進入廣州第一軍醫大學、西安第四軍醫大學,在軍醫大學取得博士學位後又用世衛組織獎學金到北國紐約洛克菲勒大學做博士研究生,這是非常典型的軍民融合專案,再到他被以千人計畫引進回國並一直從事病毒研究,其求學和工作經歷完全是軍民融合的最佳範例,而在這一次中共對全人類發起的不宣而戰的超限生物戰中,薑世勃的多肽是不是就是針對冠狀病毒的廣譜解藥?在以毒滅共日拱一卒、一日緊似一日的大形勢下,我們一定不要錯過薑世勃,因為這是目前公開資料能看到的最全面的並且已經有過成功戰例的攻克冠狀病毒的介紹。

(文章內容僅代表作者個人觀點)

注:以下為文中引用薑世勃視頻的全文字版,因G-News目前被黑癱無法上傳圖片,因此文中所附圖片將在稍後補全——

姜世勃演講的全文據搜狐網2020-04-24 12:07發佈的為什麼說廣譜抗冠疫苗和藥物是戰勝新冠疫情的終極武器? 為——

[鳳凰網科技訊 4月24日午間消息,從SARS爆發到現在已經過去17年,但為什麼我們還沒有研發出高效的抗冠狀病毒藥物和疫苗?需要吸取什麼樣的經驗教訓?又如何做好新冠病毒藥物和疫苗的研發?

在4月23日晚的《理解未來》:病毒與人類健康-專題科普講座中,復旦大學病原微生物研究所所長姜世勃為我們帶來《廣譜抗冠疫苗和藥物是戰勝新冠疫情的終極武器》的主題分享。姜世勃教授將從專業的角度分享他的觀點。

以下分享的就是姜教授的演講全文:

薑世勃:大家好!很榮幸參加此次“《理解未來》科學講座:病毒與人類健康-專題科普”,我是復旦大學教授姜世勃。今天的演講分三部分,第一部分介紹中國科學家在防控新冠肺炎疫情中所創造的幾項歷史記錄。第二部分介紹為何我們要研發安全、高效、廣譜的抗新冠病毒疫苗以及如何研發。第三部分討論為何要研發安全、高效、廣譜的抗新冠病毒藥物以及如何研發。

下面我簡單介紹一下我自己。我出生在湖北一個農民家庭,第一天上學的時候老師就把我的名字念反了,叫成了“薑勃世(博士)”,從那以後,“博士”成了我的外號,也成了我奮鬥的目標。我是我們村當時唯一一個考上初中的人,但是剛讀了一年就趕上文革,學校停課,我就回家種地。我16歲那一年,遇到我們縣招兵的連長,我應徵入伍,成了總參通信兵某連的一位衛生員/助理軍醫。在21歲那年作為工農兵學員進了廣州第一軍醫大學學習和工作,1985年又考上西安第四軍醫大學的博士研究生,1987年獲得世界衛生組織獎學金,到美國紐約洛克菲勒大學做博士後。在1990和2010年的20年間,在紐約血液中心擔任實驗室主任和研究員,2010年作為高層次人才加入復旦大學,擔任教授。

我的主要工作從事抗病毒包括愛滋病病毒和冠狀病毒的藥物和疫苗研究。在CNS、Lancet等國際英文期刊上發表465篇SCI論文和100多篇中文論文。獲授40多項專利,其中11項專利已經成功轉讓,5項產品已經上市。

2020年春節是一個驚心動魄,令人難忘的春節,早在去年11月我就已經買好了回紐約的機票,期望和家人過一個愉快的團圓年。為了給我那剛半歲的小外孫見面禮,我訂購了一箱子衣服和玩具。元月3日我在打包的時候忽然看到電視報導,“武漢市衛健委通報,武漢發現不明原因的病毒性肺炎診斷患者44例,重症11例。元月8日國家衛健委宣佈武漢不明肺炎的病原體為一個新型冠狀病毒,憑著自己17年從事SARS和MERS研究的經驗,立刻意識到一場類似於2003年SARS的瘟疫可能會爆發,所以我立即決定退票,並要求實驗室幾位還未離校的同事和研究生也要退票,組織了一個攻關小分隊。

1月11日,新冠病毒的基因上線,我們立即分析了刺突(S)蛋白序列,設計了多肽和疫苗抗原,建立了假病毒感染和細胞融合系統,聯繫了國內外多家合作單位開展基礎合作研究,聯繫國內外生物製藥公司開展臨床前合作研究以及向國內外多個基金組織申請科研基金。

(迄今為止,我們已完成了6項新冠攻關課題研究)

目前我們已經完成了6項新冠攻關課題研究,在Nature、Science、Lancet Cell、Research、CMI、EMI等英文和中文期刊發表了一系列研究、綜述和評論文章。我們於元月21日就在EMI發文呼籲“研發安全、高效、廣譜的抗新冠病毒疫苗和藥物”,同時宣傳我們國家一些科研人員在抗新冠肺炎疫情中所做出的重要貢獻。比如我們中國的三個科研團隊在10天內獨立地完成了新冠病毒的分離、擴增和全基因序列分析。比如說武漢病毒所的石正麗老師等發表在Nature的文章,在短短兩個月內,該文章已經被725000人點擊觀看,已經被引用了235次,這應該是一個歷史記錄。

(中國科學家在防控新冠肺炎疫情中所創造的世界紀錄)

比較一下2003年在廣東地區爆發的非典疫情,當時中國大陸幾乎沒有人知道它的病原體。直到三個多月後才有香港、美國、德國科學家發現其病原體和SARS冠狀病毒,文章先後發佈在Lancet等醫學雜誌。當時Science說“China missed chance”中國失去了機會,世界上早在2月26號,軍科院的楊瑞馥和朱慶余兩位老師已經在電子顯微鏡下看到冠狀病毒的圖形,但由於當時有權威認為是支原體,所以沒有發表。還有武漢病毒所肖庚富研究員的團隊,在20天內發現可用於治療新冠肺炎的藥物比如瑞德西韋、氯喹,他們文章發表在Cell Research,在短短的兩個月之內已經被98萬人次點擊,引用107次,現在這兩個藥已經在臨床使用或在臨床觀察當中。這也是一個奇跡。

319日,軍科院陳薇院士領先研發的新冠疫苗獲批臨床試驗,現在108名志願者已經完成了一期臨床試驗,同時第二期臨床試驗已經於49日開始,該科研團隊在三個月內完成了抗新冠疫苗的設計、實驗室製備、動物免疫及抗血清檢測、在新冠肺炎動物模型中的有效性評估、疫苗的cGMP製備、動物的GLP安全性評估、I期臨床試驗,這絕對也是一項世界紀錄。

國家衛健委衛生科技發展中心的鄭主任介紹,我們目前有5條研發技術路線,包括滅活疫苗、基因工程重組亞單位疫苗、病原體載體疫苗、減毒流感病毒載體疫苗、核酸疫苗等等,大概有十幾項疫苗項目正在進行中。

他特別提到研發單位元不計成本將部分串聯的研發過程進行合理並聯,有效地推進了研發過程。什麼叫“並聯”?我們按正常程式一個疫苗研究從最初抗原製備到動物免疫、中和活性鑒定、動物攻毒保護實驗、動物安全性評價到臨床試驗,一直到規模化生產,這整個過程可能需要四至五年甚至十幾年才能完成。但是現在我們希望能在一年之內完成這些工作,所以不能按照常規的方法進行。常規方法是循序漸進,一步完成以後再進行第二步、第三步,現在是多個團隊在同時進行,有人在檢測中和活性,另外有人做動物攻毒實驗、動物安全性評價以及臨床研究,多個團隊同時進行就是將串聯改成並聯。

為什麼說“不計成本”?這是有一個風險非常大的研發策略,比如一個團隊在動物攻毒實驗的時候發現這個疫苗沒有保護效果,而其它團隊已經完成的工作,如規模化生產等這些部分都前功盡棄了,可能會損失很多經費。所以,只有在特殊情況下才能採取這種策略。

美國在這方面的研究進展也很快,3月16日美國一個公司在新冠病毒基因序列公佈8周後宣佈首個新冠冠狀病毒疫苗I期臨床試驗在美國西雅圖開始,首批45名被試中的4名成年受試者接受了第一針試驗性疫苗注射。這是一種mRNA疫苗,由美國國立衛生研究院和生物製藥公司Moderna共同研發,如果這批疫苗能夠成功地通過考驗上市,它將是世界上第一個被用於預防接種的mRNA疫苗。除了這兩種疫苗外還有第三種DNA疫苗進入臨床試驗。現在全世界在研發的候選疫苗有115個,這是在WHO疫苗開發計畫清單中的疫苗,有100多個,其中5個已經進入了臨床試驗,18個進入了臨床前試驗階段。

(全世界在研的候選疫苗項目115個)

現在確認的候選疫苗78個項目中有56個是由藥廠、私人企業開發,另外22個由學術研究單位、公共部門和非營利組織牽頭,未獲確認的候選疫苗項目有37個,未在WHO開發計畫清單中備案的疫苗研究項目還有100多個,所以看到這個消息我是悲喜交加。

喜的是終於看到有56個私人藥企能夠投資研究抗冠狀病毒疫苗,這是以前絕對不敢想像的。悲的是,17年前的SARS悲劇可能再次重演。病毒一來,一哄而上,病毒一走,一哄而散。當年SARS出現的時候也是幾十、上百個抗SARS疫苗和藥物項目匆忙,但SARS過後,95%以上的項目撤掉了,造成了人力、物力和財力極大的浪費,可是一些堅持從事抗SARS藥物和疫苗研究的科研人員卻申請不到經費。我回國十年來,我們是很少幾個還在做抗SARS藥物和疫苗研究的團隊之一,工作非常困難,因為無論如何都申請不到研究基金,因為大家都認為SARS永遠不會再來,為什麼要做一些沒有意義的研究。

這次新冠出來以後全世界有800多個,中國有500多個新冠病毒相關的臨床試驗註冊,其中包括疫苗、藥物和診斷試劑,很多是重複的專案。如果此次疫情在年內緩解,絕大多數項目會立刻下馬,又要造成巨大的物力和財力得浪費。所以我建議應該由世界衛生組織和多國政府進行協調,儘快將那些重複的專案或者成功率很低的項目砍掉,將那些可能浪費的資金搶救過來用於長期戰略儲備的科研專案,比如廣譜抗冠狀病毒疫苗和藥物的研發。本世紀近20年來3次冠狀病毒的疫情造成的經濟損失多達數萬億美元,政府和各類組織如果能拿出1%損失的經費來支持廣譜抗冠狀病毒疫苗和藥物的研發,今後就可以從容地應對新發與再現的冠狀病毒疫情的爆發。

在3月17日,我在Nature發文呼籲“不要匆忙部署沒有足夠安全保證的疫苗和藥物”。文章發表後,國內外幾十家媒體要求採訪,大家都對這個事情非常感興趣,也對我的看法表示認同。大家認為安全性、有效性和廣譜性是疫苗研究中非常值得重視的。

(過去50年來發現44個新傳染病病原體)

過去50年來我們已經發現了44個病原體,只有6個疫苗成功開發上市,其中主要的難題是不能找到一個安全、有效的病毒疫苗。前不久,《Vaccine》(疫苗)雜誌主編發表評論問到:新冠肺炎疫苗能否讓接種者產生足夠且持久的抗體?如何避免由疫苗導致的疾病增強作用?希望大家不要忘記60年前呼吸道合胞病毒RSV疫苗曾留下的慘痛記憶。1966年,在美國給小孩注射RSV滅活疫苗以後,發現一些小孩得肺炎的程度比沒有接種疫苗的小孩還要嚴重,甚至會死亡。此後美國和歐洲政府投資了很多錢做新型呼吸道合胞病毒疫苗,但至今仍然沒有一個安全有效的RSV疫苗上市。也就是說RSV疫苗進行了近60年還在路上,新冠肺炎疫苗是否能在數月之內上市,這的確是令人非常關心的事情。

滅活RSV疫苗免疫引起的“增強RSV疾病”稱之為ERD。其發生的原因直到九十年代才搞清楚。發現注射戊二醛滅活的RSV疫苗在攻毒動物或感染人之後產生了Th2偏向的免疫學病理損傷,主要是產生一些Th2偏向的淋巴因數和炎症因數,肺部出現過量的噬酸性粒細胞浸潤,中和抗體水準低,而非中和抗體水準高,不能有效地啟動特異性的細胞毒性T細胞功能。

在2012年,我在美國德州UTMB的合作夥伴Tseng教授設計了三個疫苗,第一個疫苗是包含有S蛋白的疫苗,二是用化學滅活的SARS疫苗,三是用生物物理學方法滅活的SARS疫苗,然後免疫了小鼠,56天后用病毒進行攻擊,兩天后進行檢查。結果發現注射S蛋白疫苗的小鼠在攻毒後,肺部出現嗜酸性細胞浸潤,肺泡中也有很多細胞的滲出,當然還不是很嚴重,可以看到很多肺泡存在。但在注射化學滅活的SARS疫苗之後攻毒可以造成嚴重的嗜酸性粒細胞浸潤,肺泡內已被滲出細胞完全填滿,如在X光下或許可以看到“白肺”的現象。用生物物理學方法滅活的疫苗免疫所產生的病理損傷就介於兩者之間,也有細胞滲出,但是不像化學滅活疫苗引起的這麼嚴重。主要問題是顯示了Th2型偏向的免疫學病理損傷。

一個日本團隊為了弄清楚到底哪個蛋白造成了肺部的Th2型免疫學病理變化,他們用病毒表面的三個蛋白質,即S蛋白、M蛋白、E蛋白和核內的N蛋白做成疫苗,免疫小鼠後再進行攻毒。結果發現N蛋白疫苗造成非常嚴重的嗜酸細胞的浸潤和滲出,其病理損傷明顯高於E蛋白、E蛋白和S蛋白疫苗組。所以他們認為冠狀病毒N蛋白是造成肺部Th2偏向的免疫學病理的主要因素。

最近報導在新冠肺炎病人的血漿中,Th2細胞因數有明顯上調,比如說白細胞介素4、6、10和13,這樣看新冠病毒感染也有可能造成Th2偏向的炎症因數增加。

在2004年加拿大P4實驗室的Cao Jingxin主任使用能表達全長S蛋白的改良痘苗病毒載體做的疫苗來免疫雪貂,免疫後發現可以產生很高效的綜合抗體。但是在用活病毒攻毒以後,雪貂肝臟的轉氨酶增加,肝臟造成了損傷。所以他們認為用S蛋白作的病毒載體疫苗免疫雪貂在攻毒之後也可以造成嚴重的肝損傷。所以,我們做疫苗的動物試驗時,不光是用小鼠或猴子感染模型,最好也用雪貂感染模型,因為它更加敏感。有時候我們看不到疫苗免疫造成的病理損傷,也可能是使用的動物模型不夠代表性。

(基於rMVA-S的SARS疫苗)

香港大學愛滋病研究所陳志偉所長的團隊去年發了一篇文章,發現有些產生中和及非中和抗體特別快的SARS病人反而病情惡化更快。打了SARS病毒S蛋白疫苗的猴子用活的SARS病毒感染後,其肺部病理比沒有打疫苗的還要嚴重。如果將這些免疫猴子的抗體注射到健康的猴子,再用活的SARS病毒感染以後,打了這些抗體的猴子比沒有打抗體的猴子損傷更嚴重,所以他們懷疑可能是疫苗引起的一種抗體依賴性的感染增加效應,即ADE效應。單核巨噬細胞表面上沒有病毒受體ACE2,一般情況下不能被SARS病毒直接感染。但是它表面有抗體受體FcR,當病毒和非中和抗體結合之後,它不會中和病毒,反而把病毒通過巨噬細胞表面FcR侵染單核巨噬細胞,所以讓病毒能夠感染這些本來不應該被感染的細胞,造成ADE。

清華大學劉剛教授的團隊發現S蛋白的S597-603區誘導的抗體可以在體外導致非常明顯的ADE效應,然後用滅活病毒疫苗加上這個多肽以後來免疫猴子,然後再進行活病毒攻擊,結果發現會造成病變反應,這是另外一個角度反映SARS病毒的S蛋白疫苗具有ADE效應。

最近復旦大學金山公衛中心、深圳第三人民醫院、武漢大學人民醫院的科研人員發表了三篇文章,結果表明:年齡越大,血漿中和抗體及S蛋白結合抗體水準越高;抗體水準越高,粒細胞/淋巴細胞比例越高,患者病情越嚴重;血漿中的抗體水準越高,病人的病情越嚴重。這三篇文章發表以後,引起了世界衛生組織官員的高度重視,他們也懷疑這些病人的血液中可能含有ADE效應的抗體,這對疫苗的研發以及用康復期血清治療都是一個嚴峻的挑戰,應該引起高度重視。

當然,也可能我們是杞人憂天,也許新冠病毒和SARS-CoV或RSV完全不同。它可能具有超強的傳染性,但超低的疫苗抵抗性,可能任何一個抗新冠病毒疫苗免疫所誘生的抗體都能有效的抑制新冠病毒的感染。如果真是這樣的話,那將是不幸中萬幸。

最近也是捷報頻傳,中科院武漢病毒所和國藥集團武漢生物製品研究所宣佈,全球首家新冠病毒滅活疫苗已經獲得臨床試驗批准件,即將進入臨床試驗。幾乎在同一天,北京科興控股生物技術公司也宣佈,北京首支新冠病毒滅活疫苗即將進入臨床試驗。而且實驗證明該滅活疫苗免疫後在動物體內能夠產生良好的免疫反應,對動物有明顯的保護作用,也沒有觀察到ADE效應。

最近有一些文章發表,發現新冠病毒在S蛋白特別是受體結合域發生重大變化。例如,昨天剛剛發表的文章證明RBD的重要位點發生R408I突變,它和ACE2的親合力明顯降低。但目前不清楚這一突變是否會影響抗體的敏感性。所以,即使現在抗新冠病毒的疫苗能夠成功上市,但如果將來新冠病毒發生嚴重突變,這些“有效”的疫苗可能會變得無效。對未來出現的新的高致病的冠狀病毒,比如來自蝙蝠的冠狀病毒,可能同樣也沒有效果。所以研發安全、高效、廣譜的抗冠狀病毒疫苗成為當務之急。

(冠狀病毒分類)

冠狀病毒屬於模式病毒目,冠狀病毒科,分為四個屬:甲型、乙型、丙型、丁型。在乙型裡面又分為四個亞型,包括A亞型、B亞型、C亞型和DC亞型。目前大家知道的甲型裡有兩個病毒,229E和NL63,在B亞型裡有OC43和HKU1,這四個人類冠狀病毒可以感染人,但引起的症狀很輕,像感冒一樣,所以並沒有引起人們重視。直到2003年的SARS冠狀病毒,2012年的MERS冠狀病毒,和今年的新冠病毒出現以後,它們的高傳染性、高致死率才引起了人們的高度重視。我說的廣譜是指:小廣譜、中廣譜、大廣譜。小廣譜是針對B亞型的β冠狀病毒,包括SARS冠狀病毒、新型冠狀病毒以及來自蝙蝠的SARS相關病毒,這三個病毒可引起現在和未來的新型冠狀病毒疫情,而且它們都使用ACE2作為受體。所以這種小廣譜抗冠狀病毒疫苗不是很難研發出來。第二種是中廣譜,包括所有B型冠狀病毒,包括SARS冠狀病毒、新冠病毒和SARS相關病毒以及MERS冠狀病毒,這個可能比較困難一點,因為MERS冠狀病毒使用不同受體。第三種是大廣譜,包括所有的人類冠狀病毒,這是非常困難的。剛才說到不同型的冠狀病毒可能使用不同的受體,因此,它們的受體結合域氨基酸序列可能是大不相同的。

剛才談到新冠疫苗有很多類型,比如滅活疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗,根據疫苗抗原主要分為三類:一是病毒顆粒,包括滅活和減毒疫苗;二是S蛋白疫苗,包括全長S蛋白;三是受體結合域(RBD)疫苗。全長S蛋白在酶解之後分為兩個亞單位,S1亞單位含有NTD、RBD兩個重要功能區域。

(新冠疫苗抗原的分類)

這是S蛋白的空間結構。S2亞單位有三個功能區,包括融合肽(FP)、HR1和HR2,它們介導病毒和細胞的結合。RBD中間還有一個受體結合基序,稱之為RBM,RBM的氨基酸序列在各個冠狀病毒的S蛋白中變化比較大。

(RBD的中和免疫原性)

在15年前,我們團隊發表了一系列的文章證明RBD含有S蛋白中主要的中和抗原決定簇,比S蛋白和S1蛋白能誘導出更高效的綜合抗體,但更低水準的非中和抗體。從感染病人血清中分離出來的中和抗體絕大部分是靶向RBD的。絕大部分的高效價的單克隆中和抗體都是靶向RBD。基於RBD疫苗不會在免疫動物體內產生Th2偏向的有害免疫反應及肺嗜酸性細胞浸潤。從這方面來看,RBD應該是一個最安全、最有效的疫苗抗原。

滅活或減毒疫苗主要含有S蛋白和N蛋白抗原,目前的載體疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗大都是使用全長S蛋白抗原,也有用S1亞單位或RBD抗原。通過比較中和免疫原性,我們發現用RBD免疫兔子和小鼠後,其血清中和抗體效價很容易達到幾千到上萬,但使用S蛋白和S1蛋白免疫所產生的中和抗體效價要差得多。因此從中和免疫原性來看最好的是RBD,其次是S1,S蛋白和病毒顆粒。但是從誘導有害的非中和免疫原性來看,最高的是病毒顆粒,其次是S蛋白,S1和RBD。特別是誘導ADE/ERD效應來看,RBD的概率是最低的。綜合看來,RBD是研發疫苗最佳的抗原選擇。

我們準備採取以下的步驟研發高效、廣譜的抗冠狀病毒的疫苗。第一步,對RBD進行優化,增強它的中和免疫原性和廣譜性。我們將使用中和免疫原性指數(NII廣譜中和免疫原性指數(BNII來評估RBD的中和免疫原性。採用摘帽帶帽的策略優化。因為RBD中有些和受體結合的關鍵部位可能被糖基化帽子掩蓋了,我們就把它的糖基化帽子去掉。而有些部位誘導的非中和抗體過強,我們就用糖基化帽子遮蓋住。通過測試我們發現,這樣做中和抗體效價明顯上升。這個方法我們還在優化,不單提高RBD的中和免疫原性,也提高它的廣譜性。RBD中有些保守區域也可以誘導一些廣譜中和抗體,但是由於被非中和抗體顯性表位的免疫優勢所壓制,它的中和抗體免疫原性無法顯現出來。如果將這些非中和抗體顯性表位帶帽遮住後,那些比較保守的中和抗體位點就佔據了優勢,就可能產生更多的廣譜中和抗體。第二步是將優化後的RBD與含有T細胞抗原表位的蛋白片段連接形成疫苗抗原。雖然RBD也含有一些T細胞抗原表位,但更多的是在N蛋白或S蛋白的S2區,我們通過不同的方法把這些T細胞抗原表位找出來以後和將它們與RBD連接,形成一個既可以產生高效價中和抗體,也可以有T細胞免疫反應的抗原。最後我們將使用適當的免疫佐劑提高其免疫原性。

目前免疫佐劑在新冠疫苗中獲得非常高的重視,因為它可以增強疫苗抗原的免疫原性,降低其使用量,從而使更多人得到疫苗接種。比如以前小鼠接種需要10微克,用佐劑以後可以降到1微克,可以大大減少抗原的使用。現在十幾家公司宣佈將他們擁有的佐劑貢獻出來,供其它單位研發抗新冠病毒的疫苗。

(仿生納米顆粒)

今年我們和哈佛大學醫學院Wu教授的團隊合作在Science上發表文章,證明基於cGAMP基於( STING的激動劑)設計的一種肺部仿生納米顆粒(PS-GAMP),可以類比流感病毒肺部感染進入肺臟,這樣可以有效地啟動肺泡巨噬細胞和上皮細胞,促進疫苗產生高效的體液和細胞免疫反應,特別是可以抵抗多種乙型病毒感染的攻擊。比如我們用了H1N1的季節性流感的疫苗he仿生納米佐劑後,免疫動物所產生的抗體既可以抗H1N1流感病毒,也可以抗H3N2、H5N1、H7N9流感病毒,使用使用這樣的佐劑以後可以把非廣譜疫苗變成廣譜的流感疫苗。所以我們將使用同樣的技術研製廣譜抗冠狀病毒的疫苗。

下面談一下如何研發安全、高效、廣譜的抗冠狀病毒藥物。

冠狀病毒和受體結合以後,通過表面膜融合或內吞膜融合進入細胞內,在冠狀病毒酶的作用之下產生新的病毒顆粒,並釋放出來。所以這裡有兩個酶可能成為重要的廣譜抗冠狀病毒藥物的作用靶點。它們分別是MproM蛋白酶)、RdRpRNA 依賴RNA 聚合酶)。例如瑞德西韋和NHC都能作用在RdRp酶。最近饒子和院士團隊先後在ScienceNature發表了這兩個蛋白質的空間結構,為設計廣譜抗冠狀病毒藥物提供了藥物靶點的結構學基礎。我們研究的多肽主要作用在病毒的融合和進入階段,從而使得病毒沒辦法進入細胞。

病毒融合是怎樣一個過程呢?冠狀病毒表面S蛋白的受體結合域(RBD)和細胞上的受體ACE2結合,如果細胞表面有跨膜絲氨酸蛋白酶,它就可以把S蛋白切割成S1S2兩個亞單位,S2亞單位可以介導膜融合,病毒的基因物質可以進入細胞內進行複製。如果細胞表面沒有這個酶,病毒可以通過內吞的形式進入細胞內。在內吞泡中的酸性環境以及組織蛋白酶的作用下,病毒膜也可以和內吞膜泡融合,把病毒的基因物質釋放到細胞內,這是表面膜融合和內吞膜融合。我們想要設計出的融合/進入抑制劑可以作用這兩個階段,進而阻止病毒進入細胞。

我先介紹一下我30年前做的工作,那時候主要是研究抗HIV的多肽進入抑制劑。愛滋病病毒表面有gp120、gp41,CD4+ T細胞表面有兩個受體,一個是CD4,一個是共受體。當gp120和CD4結合之後,再和共受體結合,gp41暴露,其融合多肽(FP)插入靶細胞膜內,然後介導病毒膜和細胞膜的融合,因此HIV的gp41在病毒的融合過程有重要的功能。

(HIV融合進入靶細胞)

gp41的分子結構有三個重要的功能區:N端融合多肽、NHRCHR。它們的功能是介導病毒的膜融合。衍生於NHRCHR的多肽稱之為N多肽和C多肽。在90年代早期,我們發現了第一個高效抗HIVC多肽SJ-2176,它能夠抑制HIV進入細胞內,比當時最好的抗愛滋病藥-AZT的效果還好。我在1992年申請了美國專利,1993年文章發表在Nature1994年,杜克大學一些研究人員把我們多肽向右邊移動8個氨基酸,產生了新多肽T20,他們文章發表在PNAS1995年,MIT的研究人員把整個gp41用酶進行消化,發現了一個酶消化不了的複合物,從中分出來N36C34兩個多肽。而C34多肽正好比我們的SJ-2176NC段分別多兩個氨基酸,這就是當時三家單位先後發現了三個HIV融合抑制多肽的故事。

1995年杜克大學的研究人員成立了Trimeris公司,專門研發T20,但是因為他們的多肽和我們的多肽有70%以上的序列是完全一樣的,所以他們必須買斷我們的專利。後來1998年羅氏出資8.4億美元,把這個多肽推向臨床,2003年恩夫韋肽被美國FDA批准,成為第一個多肽類的HIV融合抑制劑。

(1995: 杜克大學的科研人員)

它的作用機制是什麼?這是一個病毒顆粒,表面有兩個蛋白gp120和gp41,gp120和CD4及共受體結合之後,gp41就像一個彈簧刀一樣彈開,它的融合多肽紮入靶細胞膜內,它的HR1和HR2相互作用,形成一個髮夾樣結構,三個髮夾樣結構形成一個六聚體,把病毒膜和細胞膜拉在一起發生融合,病毒的基因物質進入靶細胞內進行複製。T20衍生於病毒gp41的HR2區域,它也可以與病毒gp41的HR1區作用形成異源六聚體,這樣導致病毒的HR2不能和它作用,這樣就阻止了病毒和細胞的融合,我們稱之為“以其人之道,還治其人之身”。

(抗HIV的HR多肽的作用機制)

HIV多肽的發現開闢了多肽類病毒融合/進入抑制劑的全新領域。除了HIV以外,還有呼吸道合胞病毒、尼帕病毒、埃博拉病毒、流感病毒和冠狀病毒,都屬於I型包膜病毒。許多這些病毒都可以引起高致病傳染病,比如埃博拉、SARSMERS、新冠肺炎等。所以我們可以使用同樣的策略來研究抗這些病毒的融合多肽。

2004年我們發現第一個高效抗SARS冠狀病毒的多肽。SARS起源於蝙蝠,中間宿主是果子狸,病毒傳到人以後,感染人含有ACE2的呼吸道上皮細胞。我們當時很快的分析了S2區域的序列,找到HR1HR2的片斷,然後設計了4HR1P多肽和2HR2P多肽。我們發現HR2P多肽能夠和HR1P多肽結合形成六聚體,具有很好的抗SARS病毒的作用。它的機制和HIV非常相似。SARS冠狀病毒表面也有兩個蛋白S1S2S1和受體結合以後,S2的融合多肽紮入靶細胞膜內,HR2區和HR1區相互作用形成六聚體,把病毒膜和細胞膜融合在一起。如果我們在HR2區設計多肽,它也可以和HR1結合形成六聚體,這樣就阻止了病毒HR2HR1相互作用,也就不能形成六聚體進入病毒細胞。

我們也發現了抗MERS冠狀病毒多肽。2012年中東地區出現了MERS冠狀病毒,已經傳到全世界27個國家,近2500個確診病例,病死率達到34%。這個病毒最初來源於蝙蝠,中間宿主是單峰駱駝。這個病毒是有限人傳人,大部分還是從動物到人。

我們找到HR1和HR2區域之後,表達了HR1和HR2蛋白,做了X光衍射,發現它們也可以形成六聚體。這個六聚體和SARS六聚體很相似,一個很長的HR1區,很短的HR2區。我們設計了兩個多肽,HR1P多肽和HR2P多肽,這兩個多肽相互作用形成一個六聚體,和SARS一樣。我們發現MERS冠狀病毒的HR2P多肽能夠非常有效地抑制MERS冠狀病毒與靶細胞融合,也可以抑制MERS活病毒感染,而且它的抑制活性比抗SARS多肽抑制SARS-CoV感染的活性高幾十倍,表明了MERS冠狀病毒可能主要通過表面膜融合。

除此之外,我們又發現一個廣譜抗冠狀病毒多肽 – EK1。

世界衛生組織從2015年12月開始發佈可導致大規模爆發的嚴重疾病的清單,用於確定公共衛生緊急情況下應優先研究和解決的疾病和病原體。這個名單在2017年首次審視,2018年2月第二次審視並於同月底發佈《預測流行病行動的研發藍圖》,包括“有大爆發危機、難以防範的八大疾病”,即埃博拉、寨卡、SARS、MERS、拉薩熱、克裡米亞剛果出血熱、裂谷熱,以及第一次出現的“X疾病”,即由一個不明病原體所引發的全球性傳染病的大流行。

這個通告發出以後,我們馬上預測第一個“X疾病”很可能是由源於蝙蝠的冠狀病毒所引起。石正麗老師的團隊和其他幾個團隊發現很多來源於蝙蝠的SARS冠狀病毒,可以使用人的ACE2作為受體感染人的細胞。另外來源於蝙蝠的HKU2相關病毒也可以導致豬瘟流行。他們在雲南、山東找到幾個源於蝙蝠的SARS冠狀病毒的直接後代毒株。因此我們當時決定要儘快研發廣譜的基於多肽的冠狀病毒融合/進入抑制劑。

我們把五個現有的冠狀病毒設計了5HR1多肽和5HR2多肽,檢測這10條多肽對5個不同病毒的細胞融合作用。結果發現,衍生於不同冠狀病毒HR2P多肽都能有效地抑制同源冠狀病毒的感染,而衍生於OC43HR2P多肽可以抑制所有的5種冠狀病毒的感染。表明了OC43HR2P多肽可能是一個廣譜多肽。我們把OC43多肽進行了修飾,引入了帶有正電荷和負電荷的氨基酸,形成一個內部鹽橋,使其更穩定更有效,這就是EK1多肽。我們發現EK1OC43多肽具有更高的抑制活性,而且對我們檢測的幾種冠狀病毒,包括人的冠狀病毒和3種來自蝙蝠的冠狀病毒都有效,對細胞融合、假病毒和活病毒感染都有很好的抑制效果。

我們做了動物實驗,發現EK1多肽能有效地治療和預防OC43和MERS冠狀病毒對小鼠的感染。

我們對這幾個病毒的序列進行分析,發現他們關鍵的作用位點非常保守,我們稱為a、d和e、g位點,這就是為什麼我們設計一個多肽,能夠和所有的人冠狀病毒的S蛋白HR1區結合形成六聚體,發揮廣譜抗冠狀病毒的作用。

新冠病毒出現以後,我們立即檢測了EK1多肽的抗病毒作用。大家知道從1月首先在武漢地區報導的新冠病毒感染,至今不到4個多月,全世界超過200萬人感染,造成13萬人的死亡。這個傳播速度是以前沒有過的。

我們很快把新冠病毒S蛋白序列分析出來了,找到它的HR1和HR2區,設計了衍生於新冠病毒HR2區的多肽,實際上,這個多肽和SARS冠狀病毒S蛋白的HR2區的氨基酸序列是完全一樣的。

(新冠病毒的刺突(S)蛋白及HR1和HR2多肽的設計)

我們發現無論是新冠病毒的HR2多肽(HR2P),還是EK1都能夠和新冠病毒HR1P多肽形成六聚體。

我們建立了細胞融合實驗,發現EK1能夠有效地抑制S蛋白介導的細胞融合,也能抑制假病毒的感染。

同樣我們也解析了它的六聚體結構,發現新冠病毒和其它冠狀病毒的結構非常相似,也是由長的HR1和短的HR2形成一個核心的融膜結構。

我們對EK1多肽進行了優化,在其C端用不同長度的PEG連接膽固醇,後來發現其中一個叫做EK1C4的活性比EK1和新冠病毒HR2P多肽細胞融合抑制活性高出240倍,它抑制假病毒活性是EK1HR2P150倍,可以說是最有潛力的廣譜抗冠狀病毒藥物的候選,它的半數有效抑制濃度(IC50)可以到1.3nmol,這是非常有效的。

我們發現EK1C4能夠抑制6種人的冠狀病毒的膜融合,3種蝙蝠的冠狀病毒的膜融合,而且活性比EK1多肽高出100200倍。它還能抑制人的冠狀病毒(假病毒)和2種蝙蝠SARS相關病毒(假病毒)感染活性。除此之外,我們還研究了其對5種活的人冠狀病毒的作用,包括MERS冠狀病毒、新冠病毒、OC43229E以及NL63,發現它同樣有非常好的抑制作用。

這些工作證明,EK1C4脂多肽是高效廣譜的抗冠狀病毒多肽,將來有望能以鼻腔噴霧或者吸入劑的形式預防和治療新冠病毒、SARS-CoV、MERS-CoV感染,也可以預防和治療將來新發與再現的SARS相關病毒(SARSr-CoV)的感染,這是非常廣譜的。

(高效、廣譜抗冠狀病毒多肽— EK1C4)

下面總結第二部分內容,廣譜抗冠多肽是防控現在和未來新冠疫情的最佳武器之一。刺突蛋白HR1區是研發廣譜抗冠多肽藥物的最佳靶點之一。因為它是S蛋白中最為保守的區域,特別適合於研發多肽藥物。這個區域只能讓40kD以下的多肽或小分子蛋白進去,而抗體的分子量在150kD進不去,因此並不適合開發抗體。但小分子又太小,沒有力量阻止病毒HR1HR2區的相互作用,所以最適合研發多肽。

這個多肽容易規模化生產,生產成本遠低於抗體。我們現在國內有很多大的多肽公司,把序列交給公司以後,大概一個月或兩個月可以生產一公斤的cGMP多肽用於臨床使用。其成本是遠遠低於生產抗體的成本。多肽粉可以在常溫下儲存和運輸,而抗體必須要低溫儲存和運輸。多肽可用於預防和治療冠狀病毒感染,可以用鼻腔噴霧和霧化吸入,這個使用方法既方便又安全。比如我們要參加一個聚會,吃飯的時候不能戴口罩,可以帶上這個小噴霧瓶,提前自己噴上,避免被別人感染。如果你得了新冠肺炎感染以後,可以買一個小的霧化吸入器放在家裡面,多肽進入肺泡以後抑制病毒複製和感染,病毒載量大大降低,造成的肺損傷概率也明顯降低。同時因為降低肺部病毒載量,也減少了感染家人或其他人的機會,可以說一舉兩得。

最後感謝我們實驗室的青年才俊為我們抗SARS研究做出的重要貢獻。謝謝。

Q & A

直播間觀眾提問與解答

Q1:今天您的報告中使用的新冠病毒英文名稱為human coronavirus 2019HCoV-19,這也遵從了以往對人冠狀病毒命名的傳統,但國際病毒分類學委員會(ICTV)的冠狀病毒研究小組(CSG)卻建議將新冠病毒命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2”SARS-CoV-2),請問您對此有何看法和解釋?

A:在今年1月11日新冠病毒基因序列上線之後,媒體把它稱之為“武漢肺炎冠狀病毒”,第二天(1月12日)我和同事建議將肺炎冠狀病毒命名為“肺炎相關的呼吸道綜合征冠狀病(PARS-CoV)”,翻譯成“帕斯冠狀病毒”,並投稿。然後在1月13號即第三天,世界衛生組織(WHO)將武漢肺炎冠狀病毒命名為“2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)”。2月5號,我們有關“PARS-CoV”的文章發表在《Cell Mol Immunol》雜誌上。2月9日,我和石正麗老師建議改名為“高傳染性急性呼吸道綜合征冠狀病毒(TARS-CoV)”,翻譯成“塔斯”或“踏死”冠狀病毒,在《Virologica Sinica》(中國病毒雜誌)上發表,這樣更反映出這個病毒高傳染性的特色。2月11日,WHO將新型冠狀病毒肺炎命名為“冠狀病毒病2019(COVID-19)”。在同一天,國際病毒分類學委員會(ICTV)的冠狀病毒研究小組(CSG)在bioRxiv預印本網站上發表了一篇文章,將2019-nCoV命名為“嚴重的急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)”,但世界衛生組織並不認同,WHO的文件中還是用COVID-19病毒。2月18日,我和6位元中國病毒學專家(包括多位元新冠病毒發現者)以“新型冠狀病毒需要一個截然不同的名字”為題目,在《柳葉刀》雜誌發文,建議將新型冠狀病毒命名為“人類冠狀病毒2019”(HCoV-19),與WHO的COVID-19相對應,即病毒名和疾病名相對應。3月23日我和24位元中國病毒學專家(包括多位元新冠病毒發現者和新冠肺炎治療小組負責人)投稿到一個中文雜誌,支持HCoV-19的命名。

我們為什麼說這個病毒命名SARS-CoV-2是不合理的,因為SARS-CoV是以疾病命名,而SARS-CoV-2是以病毒之間的種系關係和分類學命名的。但給公眾的印象,新冠肺炎就是SARS。在沒有SARS-CoV-1命名的前提下,卻將新冠病毒命名為SARS-CoV-2,這會給以後的人冠狀病毒的命名體系帶來混亂。在冠狀病毒研究小組中,沒有中國大陸的專家,也沒有徵求中國大陸從事冠狀病毒研究人員的專家(特別新冠病毒發現者)的意見,這與慣例也是不符的。在系統發生關係上,新冠病毒與來自與蝙蝠的SARS樣冠狀病毒距離更近,與SARS冠狀病毒實際上距離更遠一些。所以新冠病毒既不是SARS-CoV的弟弟,也不是它的兒子,為什麼把它稱之為SARS-CoV-2?

(新冠肺炎與薩斯有非常明顯的區別)

其實新冠病毒比SARS病毒更狡猾、更難對付。新冠病毒的感染者50%以上是沒有症狀或者輕微症狀的,而SARS沒有隱性感染者的報導。新冠肺炎出現症狀前就有傳染性,而SARS一般是出現症狀後才有傳染性。新冠病毒在感染後第6天病毒載量達到高峰,而SARS冠狀病毒是在感染後第10天病毒載量才達到峰值。新冠病毒的傳染指數,最近一篇文章認為是5.7,當然各個地方可能不一樣;SARS病毒為0.85到3。由於上述種種原因,新冠病毒的傳播能力遠超於SARS冠狀病毒,這是為什麼新冠肺炎的確診人數已經超過200萬,SARS當時只有8000人。新冠肺炎的致死率目前還不是很明確,因為太多的隱性感染者沒有計算在內,如果加上隱性感染者再去掉極端的例子,比如說義大利和西班牙由於醫療資源的擠兌而導致的過高死亡率,平均死亡率大家認為在2%左右。雖然它的致死率遠低於SARS,但由於感染人數遠大於SARS,所以死亡人數也遠超SARS。另外新冠肺炎的主要致死群體是老年體弱有基礎病者,而SARS主要是青壯年。新冠肺炎的中間宿主目前是不明的,可能是穿山甲,但SARS的中間宿主是果子狸。新冠病毒以後再發的可能性是非常高的,但SARS以後再發的可能性是很低的。由此種種,如果把新冠肺炎當成SARS的話,對公眾將來是否能採取正確的防護措施會產生嚴重影響。所以我們建議還是要給新冠肺炎病毒一個獨特的名字。如果說大家一定要把新冠病毒稱為“老二”的話,不應該是“SARS-CoV-2”,或可稱之為“09流感病毒-2”或者“西班牙流感病毒-2”。因為它的很多特性,如高傳染性和低致死率,很像2019年從美國起源的流感病毒,當時稱豬流感病毒,後來很快蔓延到全世界。還有1918的西班牙流感病毒,這也和現在新冠病毒的傳播能力很相似。

Q2:謝謝您的解釋,從解釋中我們更好地瞭解了新冠病毒和SARS之間的顯著差異。今天您講座的主題是疫苗和藥物,剛才您也提到SARS已經過去17年,其實這17年各國政府、基金組織、生物醫藥公司對研發抗冠狀病毒的廣譜疫苗並不感興趣也不願意投資,這是什麼原因?您有什麼好建議。

A:這件事真是說來話長,剛才我也談到SARS出來以後不久,當時也是一窩蜂的上,上百家的藥物公司或基金組織都投資了很多錢。但SARS過去後很快就消停了,大家都不願意再做。我們這十幾年在做抗SARS藥物和疫苗研發中最頭痛的一件事就是找資金,無論政府、基金組織還是公司,幾乎沒有人願意給錢,因為大家總的印象是SARS不會再來了,為什麼浪費錢做沒有用的東西。希望通過這次新冠肺炎的教訓能夠引起國家基金組織和藥物公司的重視,剛才談到已經有50多家大型的藥物公司企業都願意投鉅資來研究疫苗。但剛剛我們也談到一個擔心就是如果這次新冠肺炎的疫情過去了會不會也出現以前的現象。可以理解,一般的藥物公司肯定不願意投錢做沒有市場回報的項目。大家都知道像這種病毒很難說以後會不會再回來。即使再回來,現在研發的疫苗和藥物可能也不會讓你賺錢的。基金組織和政府都會要你把疫苗和藥物以最便宜的價錢賣給使用者,基本上是賠本買賣,不可能賺錢,無論成功不成功都是賠錢的買賣,所以可以理解為什麼私人企業或藥物公司不願意做。希望政府、基金組織看到這個方向,很可能將來還會再出現,既然每次一來就有上萬億美元的損失,為什麼不能提前支持廣譜、高效的疫苗和藥物的研究,做好長期戰略儲備。一旦將來再出來就沒有後顧之憂了,當然也希望有社會責任心的公司也能提供一些資金來支援這些研究。謝謝。

Q3:這次疫情發生以後各個國家對疫苗的研究非常重視,現在進入臨床的速度也非常快。您認為這次新冠病毒疫苗研發會創造一個奇跡嗎?是否能成為今後研發抗新發突發傳染病疫苗的一個通用策略?

A:這次的研究發展趨勢的確是一個奇跡,剛才我也談到,本來研究需要幾年、十幾年的研究過程,但大家都把它縮短到幾個月,這的確是一個世界奇跡。但將來能不能成功,不是取決於我們,而是取決於病毒。這個病毒到底能不能對疫苗有效,會不會出現像呼吸道合胞病毒或者登革熱病毒一樣,對疫苗產生的ADE抗體或者有害免疫反應,目前說它是否成功還為時過早。但這個模式是很好的,對將來再出現新發突發傳染病也應該採取這個措施。當然希望由政府和各級組織協調好,不要盲目地一窩蜂而上,應該由大家挑選一些有成功疫苗研究經驗的公司,比如說這些公司長期以來一直在研究載體疫苗或者研究mRNA疫苗,有現成的設備,有以前其他的成功經驗。我們應該投資到這些公司,讓他們儘快研究這種類型的疫苗,但不要讓大家一窩蜂的上。據說現在在國際上做滅活病毒疫苗就有幾十家單位,好像大家一分離出了活病毒立刻就想做滅活病毒疫苗,這樣的確是一個浪費。希望從這次疫情之後各級政府或者基金組織能夠吸取教訓,儘快地協調好,讓大家能夠有效地把疫苗和藥物儘快地推向市場,並做好提前的戰略儲備。(補充:1月17日,美國NIH聯合衛生部戰略儲備處,FDA,CDC和十幾個大藥廠,挑選最有潛力成為安全有效疫苗或藥物的專案,進行聯合攻關(https://www.nih.gov/news-events/news-releases/nih-launch-public-private-partnership-speed-covid-19-vaccine-treatment-options?from=singlemessage)。我國科技部組織的新冠肺炎防控科研攻關組中的八個專班中疫苗專班採取了類似的策略,現已有三個候選疫苗進入或完成一期臨床試驗,在國際上處於領先地位。但在藥物攻關方面卻不盡人意。雖然有一到兩百個新冠肺炎治療項目註冊臨床試驗,但其中大部分是科技含量不高且重複專案,既浪費了資金,又擠兌了寶貴的臨床實驗資源,一些真正有原創性和高科技含量的專案反而被排斥在外。希望科技部也能組織一個由藥監總局,疾控中心,和大藥廠的聯合攻關組在全國挑選(而不是自由申請)最有潛力成為安全高效的抗新冠肺炎的藥物進行聯合攻關,像疫苗那樣儘快推向臨床,不要在藥物研發方面落後于歐美國家)。

Q4:關於新冠病毒疫苗的研發現在很難估計我們還會遇到什麼困難。您講座中也提到根據SARSMERS疫苗研究的一些情況,可能會有ADE的情況出現,也有聽眾提到這樣的問題。比如說世界各地現在很多感染者,這裡面也包括(至少媒體聲稱)複陽的,感染群體中有沒有類似ADE情況的出現?另外從您自己的研究來看,S蛋白RBD是最佳的疫苗候選的一個區域。但是,為什麼現在疫苗大部分又用全長的S蛋白作為免疫原,這樣是不是無形中增加了可能產生ADE的風險?能不能給我們解釋一下?

A:目前為止還沒有明確的報導說病人的血清中的確有ADE抗體,但是從剛才說的三篇文章中的確出現一個很怪的現象,為什麼抗體越高的,病情反而越嚴重?一般來說,你被病毒感染以後產生的中和抗體應該能夠有效的抑制病毒的感染。現在結果正好相反,產生抗體過快的或者過多、過高的病人,反而病情更加嚴重。當然這還需要更多的實驗證明這些抗體中是否含有具有ADE效應的抗體。現在這種ADE試驗還比較難做,特別是用動物模型。也可以用體外試驗來檢測,用不表達ACE2的細胞,但表達有FcR的細胞來檢測。就是說含有ADE效應的抗體抗體可以使病毒通過FcR進入不易感細胞,比如單核巨噬細胞。現在有關對新冠病毒有ADE效應的抗體還沒有太多這方面的報導,但是對SARS冠狀病毒有ADE效應的抗體有很多報導。剛才說最好的模型是動物感染模型,除了能表達人ACE2小鼠模型外,我認為最好的動物模型是雪貂,因為其更敏感,用雪貂檢測抗體是否有ADE效應可能更好。剛才說ADE效應是其中一種,還有一種不是抗體介導的有害免疫反應,可能因為某些病毒蛋白刺激產生的過多的炎症因數,造成炎症因數風暴,特別是使用完整的病毒顆粒(如滅活或減毒疫苗)做的疫苗,因為完整病毒顆粒中什麼蛋白都有,比如SARS病毒的N蛋白很容易刺激產生炎症因數風暴,滅活病毒(疫苗)進入人體後所產生的炎症因數風暴與用活病毒感染可能是同樣道理。這個試驗都是要在用一個敏感的動物感染模型進行攻毒以後再檢測,這些動物實驗目前還是不太容易作的。

剛才談到為什麼很多公司還是用S蛋白呢?大家總是相信冠狀病毒的S蛋白免疫動物不會產生ADE效應。的確,用SARS滅活疫苗免疫動物很容易看到這種現象,如肺部過量嗜酸性粒細胞浸潤,還有Th2偏向的免疫病理反應。但是用MERS冠狀病毒的S蛋白免疫動物就沒有那麼嚴重。或許新冠病毒會不同於SARS冠狀病毒?過去滅活病毒或全長S蛋白作SARS疫苗都沒有成功的先例。美國剛開始有人用滅活SARS病毒作疫苗。後來據我所知,滅活SARS病毒疫苗全部下馬。後來大家都用S蛋白,其中有一個公司投資了幾千萬做了全長S蛋白疫苗,可能也是在使用感染動物來檢測疫苗的體內有效性時發現一些問題,後來該項目下馬了。現在,已有幾個用 S蛋白做的MERS疫苗已經進入或完成一期臨床試驗,目前都沒有發現明顯的安全問題。所以,這些公司這次依舊用S蛋白(也可能有人用RBD做疫苗的)。如果用S蛋白作載體疫苗,對這些公司來說,是最快、最經濟的策略,因為他們在這方面已經有作SARS和MERS疫苗的經驗,還有現成的質粒,可以直接拿來就用。這是我的理解,也許他們有不同的想法。

Q5:對於一個新發傳染病,剛剛發生的時候肯定沒有特效藥,老藥新用是一般的常用策略。請問對新冠病毒,老藥新用的整體情況怎麼樣。我們看到一些原來寄希望的藥物,從一些臨床結果看不像預期那樣,您感覺對新冠病毒而言這個策略前途如何?您能不能預測哪個老藥可能是最有希望的?

A:“老藥新用”的優點就是快,因為任何一個新病毒疫情出現,大家都會採用同樣的策略,就是在實驗室快速篩選FDA藥物庫,篩選到以後馬上可以進入臨床試驗或者進入臨床對於一些危重病人進行“同情治療。理論上講這些“老藥”是安全的,因為它們已經臨床使用很多年,而且當時申報的時候已經完成了一、二、三期臨床試驗,對人應該是安全的才會獲得藥監部門的批准,所以只要在實驗室證明該“老藥”對新冠病毒感染有抑制作用就可以馬上申報臨床實驗。剛才說到武漢病毒所肖庚富老師的團隊在20天內就找到了兩個“老藥”(瑞德西韋和綠喹),可以馬上進入臨床試驗。對於任何一個新發病毒,這都是很好的策略。但是它的缺點就是,這些藥物原來的作用靶點並不是在這種病毒上,而是作用於其他病毒的,比如當時最火的克力芝這個是抗愛滋病藥物,當時作用細胞內蛋白酶的,實驗室的研究當時也有一些效果,最後臨床試驗證明是失敗的。瑞德西韋這個藥作用機制比較明確,它最初臨床試驗是用來治療埃博拉的,美國北卡大學Ralph Baric的團隊幾年前做SARS和MERS冠狀病毒抑制試驗發現有效,是作用在冠狀病毒的RdRp上,目前做了很多臨床試驗。但很遺憾,中國的重疾臨床試驗已經撤下來,因為招募不到足夠的病人,現在世界上很多國家開始做它的臨床試驗,希望能有好的治療結果。在目前所有“老藥”來看,它是最有希望的。其他的法匹拉韋、利巴韋林、氯喹、阿比多爾現在也在臨床實驗。現在已經證明失敗的是克力芝和阿比多爾,法匹拉韋的臨床效果還沒有獲得確認。利巴韋林被稱之為“萬能抗病毒藥物”,但我認為它是“萬不能抗病毒藥”。任何一個新病毒感染病出來以後,都有人用利巴韋林治療,但目前為止,還沒有發現它對任何一個RNA病毒能夠非常有效的抑制,所以,目前也不是很看好。氯喹是目前爭議最大的,有幾個報告是效果非常好,所以美國總統特別推薦它,甚至要求美國FDA儘快批准。但是也有幾篇報導,效果並不好、不理想。有些專家認為這些報導的臨床效果大都是從沒有經過嚴格設計的臨床試驗中獲得的。最近我們看到有些報導說它的毒性還很大。毒性不光是因為它本身的毒性,很可能是在臨床應用中聯合使用多種其他藥物的時候出現的協同毒性作用。這些“老藥”在其原始的臨床實驗的時候是單獨使用的,但是治療新冠病毒肺炎的時候,因為不知道哪個藥有效,所以多個藥一起上。有的是氯喹、瑞德西韋、克力芝一起上,這樣就有可能協同毒性,將某藥的毒性放大了。所以氯喹是否被證明真正有效,還需要等待一定的時間。

Q6:您今天重點介紹了多肽藥物。請問您對抗冠狀病毒小分子化學藥物有何期待?哪些藥物靶點前景較好?關於疫苗和藥物的靶點,除了在病毒進入階段和病毒複製階段有很多熱門的研究和疫苗/藥物的候選,在病毒的生命週期的其它階段,有沒有潛在的靶點呢?比如針對病毒翻譯中保守的核糖體進入位點IRES序列等,是否可行?

A:前一段時間饒子和院士團隊已經解析了M蛋白酶(Mpro)和RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)的空間構型三維結構,同時也找到了小分子化合物針對這幾個藥物靶點的。現在,北卡羅來納大學(UNC)的Ralph Baric團隊發現核糖核苷類似物β-D-N4-羥基胞苷(NHC)對很多mRNA病毒,包括埃博拉病毒、RSV都有一定的抑制作用。所以目前我認為現在最好的靶點大概就是Mpro和RdRp,這兩個是目前來看最有希望作為廣譜小分子化合物的靶點,因為它們可以進入細胞內。其它方面,如宿主限制因數,目前大家還沒有看到很好的結果。很多現在有研究人員在選擇宿主限制因數。前段時間有報導發現來自於蝙蝠的蛋白限制因數在人體內可以起作用。限制因數的確是很好的研究方向,但是要做成藥的話還有很長的路要走。抑制愛滋病毒的,也有很多限制因數,但目前還沒有一個愛滋病的限制因數成藥。就限制因數而言,除了需要考慮它本身的作用機制外,還有一個主要因素是它是人體內部的蛋白質,因為任何人體內的蛋白質總有它的功能,所以針對人體蛋白來做藥是有一定風險的。剛才談到病毒融合,除了多肽以外,還希望能找到一些受體的拮抗劑,比如說ACE2或者酶的拮抗劑,比如跨膜絲氨酸酶拮抗劑或者組織蛋白酶抑制劑,用它來進行治療。大家談的最多的就是ACE2,能不能把ACE2整個表達出來讓它和病毒結合,或者用抗體把ACE2給block掉而使病毒結合不上?這的確有先例,愛滋病毒有一個受體CCR5,現在有一種藥物maraviroc就是愛滋病毒受體拮抗劑。但是CCR5是一個很特殊的受體,因為約6% 的盎格魯-撒克遜人先天就有CCR5△32突變,就是在CCR5基因中有32個核苷酸的缺失突變,但是攜帶有這種突變的人照樣活得很好,沒有問題。這可能是因為在千萬年的進化過程中,他們的CCR5的功能可能被另外某一個蛋白所代替,即使沒有了照樣可以很好地生活下去。但是對於其他群體比如說華人,如果沒有這種在進化過程中產生的先天突變,這時候直接把他們的CCR5基因敲掉,後果就很難預測,所以還要根據具體情況來決定。另外血管血管緊張素轉換酶2(ACE2)本身有很重要的功能,所以如果把它的功能封閉以後,對其在人體內的功能可能造成嚴重的副作用。即使把它表達出來,注射人體,ACE2也可以和其正常功能靶點結合,也可能會造成副作用。某些人體內的蛋白酶也是同樣的情況,這些蛋白酶雖然是介導病毒膜融合的,但它們在人體內也是有正常功能的,如果在人體內把它的功能抑制是可以抑制病毒感染,但同時對其在人體內的正常功能也可能受到影響。我一直認為還是應該針對病毒蛋白而不應該針對人的蛋白,也許很多人不同意,這只是我自己的看法。]

*******原文引用完畢*******

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NewFOC

4月 02日